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CRISPR/Cas9 是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas9 系统通过将入侵噬菌体和质粒 DNA 的片段整合到 CRISPR 中，并利用相应的 CRISPR RNAs（crRNAs）来引导对特定位点的DNA进行切割，形成双链DNA缺口，然后细胞会借助同源重组机制或者非同源末端连接机制对断裂的DNA进行修复。如果细胞通过同源重组机制进行修复，会用另外一段DNA片段填补断裂的DNA缺口，因而会引入一段新的遗传信息，引起突变或缺失，导致目标蛋白不表达或者降解，起到敲除效果。 假如我们要研究重要的肿瘤抑制子PKM2的功能，最重要的就是进行敲除。如何有效的敲除就至关重要。下面我就以敲除PKM2为例来给大家讲述如何运用高大上的Cas9技术随心所欲的敲除蛋白。 一、设计几条有效的sgRNA 1.进入ensemble网站http://asia./index.html?redirect=no，在图示的位置选择或输入查询的PKM2基因。 2.进入后选择转录本 3.继续选择转录本 4.选择有效的转录本 5.选择进入外显子 6.此时我们可以看到PKM2含有11个外显子和10个内含子 7.在ATG下游100bp左右选择一段DNA序列： GGACATTGATTCACCACCCATCACAGCCCGGAACACTGGCATCATCTGTACCATTG 进入http://crispr./ 将DNA序列输入其中。 8.获取sgRNA序列 9.选择sgRNA序列 二、构建cas9-sgRNA质粒 三、使用cas9-sgRNA质粒敲除目的基因 1.在293T细胞中使用慢病毒包装的方式表达cas9，收集病毒上清。 2.使用病毒上清感染Hela细胞，感染48h后，用含有嘌呤霉素的培养基筛选或者挑单克隆细胞即可获得敲除目的蛋白的细胞系。 |
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