无缝克隆在线引物设计软件上线啦！

无缝克隆是将目的片段按照一定方向拼接到线性化载体上的一种基因克隆方法，目的片段可以是一个或多个，载体线性化可使用酶切或者PCR的方式。使用这种方法进行载体构建时，不局限于酶切位点，且可以连接几个片段到载体上，故相对于传统酶切连接载体构建的方法，无缝克隆更为简单、快速、省时、省力。

完成无缝克隆，引物设计必不可少！全式金无缝克隆引物软件带您体验5分钟完成引物设计，配合无缝克隆试剂盒，轻松愉快完成无缝克隆。

现在就带您走进无缝克隆引物设计软件 ——

一、登录方式

按照下图所示的操作流程，就可以登录进入无缝克隆在线设计软件了。

二、使用方法

根据实验需求，对载体的线性化方式进行选择：单酶切、双酶切和PCR扩增，选择不同的标签，下面的内容会有所不同。

1. 单酶切线性化载体的操作步骤

（1）选择单酶切线性化；

（2）将载体序列粘贴到相应的位置。这里要注意，一定要保证所选的酶切位点在我们所输入的载体序列上是完整的，否则可能不能识别；

 

（3）在选择酶切位点之前，要确定进行无缝克隆时，是否需要保留线性化载体时所用的酶切位点，可以根据需要进行选择；

 

（4）选择我们线性化载体时所用的内切酶，直接点击就可以弹出下拉菜单，选择相应的内切酶即可；

 

（5）选择需要插入片段的个数，最多可以选择5个；

（6）将插入片段序列粘贴到“插入DNA片段”下方的方框中；

（7）点击下方的“生成引物”即可得到您无缝克隆所需要的引物；

（8）下图就是生成的引物序列，将这个序列复制下来就是您的无缝克隆引物了。

了解了单酶切线性化载体的无缝克隆引物设计操作方法，是不是觉得很简单？

下面来看一下双酶切线性化载体的无缝克隆引物设计操作方法，与单酶切的方法很相似。

2. 双酶切线性化载体的操作步骤

（1）选择双酶切线性化；

第（2）（3）步与单酶切线性化载体的操作步骤相同。

（4）选择线性化载体所用的两个内切酶；

其余的步骤跟单酶切线性化完全一样，不再赘述。

3. PCR扩增线性的载体的操作步骤

PCR扩增线性化的载体的引物设计与前面两种稍有不同。

（1）选择PCR扩增线性化；

（2）在下方的两个方框中分别输入克隆位点上游序列和克隆位点下游序列，上下游每个至少要20个碱基；

 

（3）选择需要插入片段的个数，最多可以选择5个；

（4）将我们的插入片段序列粘贴到“插入DNA片段”下方的方框中；

（5）点击下方的“生成引物”即可得到您无缝克隆所需要的引物（图片展示可参考单酶切线性化、双酶切线性化载体操作步骤）。

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以上是本期为您介绍的无缝克隆在线引物设计软件使用指南，希望对您的实验所有帮助，下期见！