无缝克隆模拟，三分钟看清无缝克隆怎么完成重组！（GenomeCompiler法）

图文教程：https://mp.weixin.qq.com/s/30hKg5OT-eWn_G0XNh1mcA

 

与之前介绍的模拟构建方式一致，我们以pEGFP-C1构建human p53 CDS过表达载体为例。

Nucleotide: https://www.ncbi.nlm./nuccore/

在NCBI获取基因序列（fasta），要是不会的可以看看上面放的往期的内容。

获取第一转录本CDS序列

经TA克隆的目标基因序列直接使用测序结果进入下一步

SnapGene：http://www./resources/plasmid_files

SnapGene获取载体图谱序列

进入GenomeCompiler界面。

在Tools 菜单中进入Clone选项。

在新页面中选择吉布森组装，点击进入下一步。

进入克隆工作界面后（提示是否加载一个背景），所以我们选择或输入载体序列。

筛选线性化方式

选择酶切，加载内切酶；选定作为背景的载体片段。在右侧的信息展示栏中可以判断我们的酶所在选择的序列是否正确。

然后进入下一步，点击添加。

在弹出页面中选择添加片段；

           

在右侧菜单栏中选择或输入片段序列；

完成后选择插入片段范围进行微调，通常选择整个插入片段全部插入。下方提示调整长度改变引物Tm。

最后点击设置反应条件，点击保存。

筛选完成后会提示是否只插入一个片段或者继续添加，插入单片段就点击【YES】确定引物和片段进入下一步。

在新页面中设置同源臂长度进行组装。

红框内显示生成产物；蓝框内显示生成引物。

在产物中切换到序列视图。

检查序列的融合情况。

首先找到GFP的读码框（比较靠后），同时找到p53的读码框（比较靠前），经判断是否为3的倍数，因此表明p53与GFP是完整融合的。GenomeCompiler进行无缝克隆模拟的好处就是，它的引物设计会自动考虑前面的标签序列与插入片段之间的融合性自动进行微调。

这样我们就完成了GenomeCompiler进行无缝克隆的模拟。