【原】同源重组克隆技术构建质粒

分子克隆 是在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。利用酶学原理，在体外将不同来源的片段与载体通过酶切，连接的操作重组成一个杂合分子，再通过转化与转导的方式，引入到合适的宿主细胞中进行复制和扩增。

传统的构建重组质粒的方法为TA克隆。该方法需要将构建进载体的片段通过PCR技术引入合适的酶切位点扩增出来，随后与T载体进行连接。将连接好的质粒转化大肠杆菌进行扩增，随后对扩增好的质粒进行酶切，得到含有粘性末端的片段。将该片段与同样经过双酶切的载体进行连接，转化大肠杆菌后即可得到重组质粒。

图一 TA克隆流程图

然而传统的TA克隆存在诸多缺点，比如实验周期较长、受片段上的酶切位点影响等等。而同源重组克隆技术可以完美的解决这些缺点。同源重组克隆技术是在重组酶的作用下，通过识别同源臂上的同源序列，可以将外源片段直接重组到载体上的克隆技术。

图二 同源重组原理图

同源重组克隆技术在进行TA克隆构建重组质粒时，需要考虑外源片段上是否有需要用到的酶切位点，如果有的话，则在后续进行双酶切时会对片段进行酶切，因此无法正确的构建重组质粒。而同源重组克隆技术进行构建质粒时，是不需要对片段进行酶切的，因此无需考虑片段上的酶切位点。

在进行同源重组克隆时，设计的引物由两部分组成，分别为同源臂和基因特异性引物，其中同源臂为载体框架上的带酶切位点的序列。扩增出的带有同源臂的片段后需要与线性化载体进行重组。线性化载体可以通过双酶切或者反向PCR扩增得到。重组反应需要在重组酶的说明书下进行。

实施案例需要构建Lenti-Ef1a-X-GFP重组质粒，已有Lenti-Ef1a-GFP和pCDNA3.0-X质粒。

引物设计诺唯赞官网提供了同源重组引物在线设计网站：

https://crm./cetool/singlefragment.html

PCR扩增及线性化载体

使用设计好的引物扩增X片段，随后对pLenti-EFIa-P2A-GFP进行双酶切，制备线性化载体。

图三 片段扩增，线性化载体

重组反应将扩增片段与线性化载体琼脂糖凝胶电泳后进行回收，回收的片段按照重组酶的说明书进行重组反应。重组反应结束后转化至DH5α感受态细胞中进行转化、涂板

挑单克隆测序验证次日挑选单克隆进行测序验证。