限制性和功能性氨基酸组合添加对瘤胃发酵特性的影响

作者：韦 肖   刘作桂   李 川   李艳娇   欧阳克蕙   邱清华

导读：试验旨在探究限制性氨基酸和功能性氨基酸组合添加对瘤胃发酵特性的影响。将赖氨酸（Lys，0、0.25%、0.50%）、蛋氨酸（Met，0、0.075%、0.150%）、精氨酸（Arg，0、0.15%、0.30%）和谷氨酸（Glu，0、0.01%、0.02%）正交[L9（34）]组合成9种处理，每个处理5个重复，体外发酵24 h后收集发酵液检测瘤胃发酵特性指标。结果表明：①添加0.25%和0.50%的Lys显著提高了甲烷的产气量（P<0.05）；②添加0.25%和0.50%的Lys、0.150%的Met显著提高了pH（P<0.05）；添加0.25%和0.50%的Lys、0.150%的Met显著降低了微生物菌体蛋白的浓度（P<0.05）；添加0.50%的Lys显著提高了氨态氮的浓度（P<0.05）；③添加0.25%的Lys显著提高了乙酸和总挥发性脂肪酸的含量（P<0.05）；多项指标综合指数（MFAEI）分析发现，添加0.075%的Met、0.01%和0.02%的Glu为负数。综上所述，添加0.25%的Lys可以在一定程度上改善瘤胃发酵，在本试验的高产奶牛日粮中无需额外添加Met和Glu。全文已在《饲料工业》2022年第19期刊出。

传统反刍动物营养学认为，瘤胃微生物能将日粮中的蛋白质或非蛋白氮降解合成微生物菌体蛋白，在一般情况下不需要在日粮中额外添加氨基酸就能满足机体和产出的畜产品对于氨基酸的需求。随着奶牛产奶性能的提高，奶牛机体代谢强度增加，对氨基酸需求量随之增加，日粮降解和微生物合成的氨基酸可能无法满足高产状态下的需求量。王洪荣等[1]在体外培养试验中发现，氨基酸缺乏会影响瘤胃微生物的生长和繁殖。而将氨基酸作为氮源时，更有利于微生物的生长和微生物蛋白质的合成[2]。因此，理论上可以在高产奶牛日粮中通过补饲氨基酸来优化瘤胃发酵。

蛋氨酸（Met）和赖氨酸（Lys）是反刍动物主要的限制性氨基酸。在以玉米和豆粕为主的常规日粮中，蛋氨酸是第一限制性氨基酸，但在玉米和玉米副产物比例较高时，赖氨酸是第一限制性氨基酸[3]。在奶牛上的研究发现，补充赖氨酸和蛋氨酸有利于改善瘤胃健康并提高产奶性能和牛奶品质[4-6]。功能性氨基酸近年来在反刍动物营养研究中受到越来越多的关注。精氨酸（Arg）是尿素、一氧化氮和多胺类物质的合成前体，是动物生长、繁殖和体内稳态代谢途径中的重要调节因子[7]。虽然反刍动物体内可以合成精氨酸，但在生长或者高产状态下，从头合成途径无法满足精氨酸的需求[8]。Chacher等[9]在体外培养试验中发现，与不添加氨基酸组相比，补充精氨酸可以提高发酵12 h的pH以及产气量、氨态氮和总挥发性脂肪酸含量。谷氨酸（Glu）是细胞内最丰富的氨基酸，可以转化形成其他氨基酸用于维持肠黏膜的完整性，与限制性氨基酸配合使用时，理论上对于蛋白质代谢有叠加效应[10]。然而，Jackeline等[10]在犊牛代乳料中添加赖氨酸、蛋氨酸和谷氨酸后，并没有提高犊牛的肠道健康水平。这些结果可能与动物的生理状态相关。对于高产奶牛高精料饲喂模式下限制性和功能性氨基酸的组合添加效果，目前尚无报道。

本试验采用体外发酵技术探究限制性氨基酸[赖氨酸（Lys）、蛋氨酸（Met）]和功能性氨基酸[精氨酸（Arg）、谷氨酸（Glu）]组合添加对瘤胃发酵特性的影响，以期为高产奶牛日粮的氨基酸优化供给提供理论基础。

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材料与方法

1.1 试验材料

试验所用的氨基酸均购自上海麦克林生化科技有限公司，Lys、Met、Arg和Glu的CAS编号分别为56-87-1、63-68-3、74-79-3和56-86-0，纯度均≥99%。

1.2 试验设计

采用正交设计，将占发酵底物不同质量比例的Lys（0、0.25%、0.50%）、Met（0、0.075%、0.150%）、Arg（0、0.15%、0.30%）和Glu（0、0.01%、0.02%）组合成9种处理（见表1），Lys和Met添加量的选取参照Hosford等[11]，Arg和Glu的添加量分别参照Teixeira等[8]和Jackeline等[10]的报道。每个处理设置5个重复，以高产奶牛的日粮为发酵底物，每个重复添加发酵底物0.40 g，加入60 mL混合培养液（其中新鲜瘤胃液20 mL，人工唾液40 mL，瘤胃液取自4头长期饲喂该底物的奶牛）模拟体外瘤胃发酵，在培养24 h后终止发酵，将发酵液经四层纱布过滤后作为后续检测的样品。体外发酵具体操作规程参照之前的研究[12]。发酵底物组成（干物质基础）为商业化精饲料57.94%、进口苜蓿18.54%、进口燕麦2.64%和玉米青贮20.88%，营养水平为粗蛋白16.9%、产奶净能7.3 MJ/kg、中性洗涤纤维31.0%。

1.3 指标检测

1.3.1 产气量与有机物消化率

在发酵后的3、6、9、12、18 h和24 h时记录每个发酵瓶的气体产量，各时间段的产气量之和为24 h的总产气量。甲烷（CH4）产量采用Moss等[13]的公式估算。

1.3.2 pH

终止发酵后立即采用便携式pH计（雷磁PHBJ-260，上海仪电科学仪器股份有限公司，上海）测定发酵液的pH，每个重复测定3次，取其平均值作为该发酵液的代表值。

1.3.3 氨态氮（NH3-N）

将四层纱布过滤后的瘤胃液先在4 000 r/min离心10 min，后取上清液参照Broderick等[15]描述的苯酚-次氯酸钠化学比色法进行NH3-N含量测定。

1.3.4 微生物菌体蛋白（MCP）

将样品2 100 r/min离心5 min，取上清液在13 000 r/min再次离心30 min后弃上清液，加入纯化水重悬，再以13 000 r/min离心30 min，弃上清液后加入1%的NaOH溶液，洗涤3次后加入NaOH溶液在100 ℃水浴锅中水浴10 min，在13 000 r/min离心40 min后取上清液参照Makkar等[16]报道的方法测定MCP含量。

1.3.5 挥发性脂肪酸（VFA）

将瘤胃液样品10 000 r/min离心15 min后，取上清液与0.2倍体积的25%偏磷酸均匀混合，再次10 000 r/min离心15 min后取上清液过滤膜后上机。测定的挥发性脂肪酸包括乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸。采用的是气相色谱法，所用仪器为岛津GC2014，样品进样量为0.4 μL。色谱柱温控程序如下：初始温度120 ℃保持2 min，以5 ℃/min的速度升温至180 ℃并在180 ℃处保留1 min。整个过程中，分流比设置为40：1，流速保持为3.0 mL/min。通过气相色谱仪运行得到色谱图后，采用峰面积外标法，基于相对保留时间确定各种挥发性脂肪酸及其对应的含量。

1.4 多项指标综合指数（MFAEI）

多项指标综合指数（MFAEI）是每个单项指标综合指数（SFAEI）相加的总和。

结合本试验实际，将n=1和A3=A2带入公式，公式可简化为SFAEI=（A2-A1）/A2，其中A1是未添加组（对照组，添加水平为0）的数值，A2为对应添加水平下的数值。

1.5 统计分析

所有数据采用SPSS 20软件进行多因素方差分析，各主效应不同水平之间用Tukey进行多重比较，规定P<0.05为差异显著。

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结果与分析

2.1 氨基酸组合添加对产气量、甲烷产量与有机物消化率的影响（见表2）

由表2可知，4种氨基酸的添加对24 h的总产气量和有机物消化率均没有显著影响（P>0.05）。与未添加Lys组相比，添加0.25%和0.50%的Lys均显著提高了甲烷的产气量（P<0.05）；添加0.15% Arg的甲烷产量显著高于0.30% Arg组（P<0.05），但与不添加Arg组没有显著差异（P>0.05）。

2.2 氨基酸组合添加对pH、MCP与NH3-N浓度的影响（见表2）

由表2可知，4种氨基酸的添加均会显著影响发酵液的pH，其中添加0.25%和0.50%的Lys、0.150%的Met均会显著提高发酵液的pH（P<0.05），但0.15%的Arg和0.02%的Glu会显著降低发酵液的pH（P<0.05）。添加0.25%和0.50%的Lys、0.150%的Met均会显著降低MCP的浓度（P<0.05）。添加0.50%的Lys显著提高了NH3-N的浓度（P<0.05）。

2.3 氨基酸组合添加对VFA含量的影响（见表3）

由表3可知，添加0.25%的Lys显著提高了乙酸的浓度，0.50%的Lys、0.075%和0.150%的Met均显著降低了丙酸的浓度（P<0.05）。添加0.01%和0.02%的Glu均显著降低了异丁酸的浓度（P<0.05）。添加0.25%和0.50%的Lys显著升高了丁酸的浓度，而添加0.02%的Glu显著降低了丁酸的浓度（P<0.05）。添加0.075%和0.150%的Met、0.30%的Arg、0.02%的Glu均显著降低了异戊酸的浓度（P<0.05）。添加0.075%的Met、0.30%的Arg均显著降低了戊酸的浓度（P<0.05）。添加0.25%的Lys显著提高了总挥发性脂肪酸的含量（P<0.05），添加0.075%的Met显著降低了总挥发性脂肪酸的含量（P<0.05）。

2.4 瘤胃发酵参数的综合评定（见表4）

综合评定参考卢德勋[17]提出的多项指标综合指数（MFAEI）。由表4可知，在本试验中，以不添加氨基酸组作为参照，对产气量、pH、MCP、NH3-N和总VFA含量分别计算单项指标综合指数（SFAEI），同一添加水平上述指标的SFAEI相加即为MFAEI。对Lys而言，添加0.25%的MFAEI数值大于添加0.50%，且均为正值；对0.075%的Met、0.01%和0.02%的Glu而言，MFAEI均为负值；对Arg而言，0.15%的MFAEI大于0.30%，且均为正值。

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讨论

产气量可以用来评价发酵底物的降解程度，常用来指示饲料原料的消化率[18]。发酵底物中的酸性洗涤纤维（ADF）含量是影响底物降解率的主要因素，其含量越高，产气量越低[19]。本试验氨基酸的添加并没有改变底物中的ADF含量，因此会出现总产气量和有机物消化率均不受影响。NH3-N可以反映日粮蛋白的降解程度，由微生物分解日粮中的氨基酸和多肽产生；同时，瘤胃中的NH3-N也可用作微生物生长和繁殖的氮源；因此，NH3-N的浓度是日粮蛋白降解和微生物利用降解蛋白之间的一种动态平衡表现[12]。本试验发现，Lys的添加提高了NH3-N的浓度，并且这种提升作用随着添加量的增加而加强，这可能是额外添加Lys提高了降解生成的NH3-N含量，而微生物的利用相对恒定，最终使得积累的NH3-N浓度上升。瘤胃MCP是反刍动物重要的蛋白质来源，其产量的高低与微生物组成和活性、日粮中的非纤维性碳水化合物含量以及瘤胃食糜的通过速率相关[20-21]。Lys和Met的添加降低了MCP的产量，并且降低程度随着添加剂量的增加而增加，这可能是两者的添加抑制了微生物的活性，使得合成量降低，然而这个猜想需要通过检测微生物的活性和多样性来进一步验证。瘤胃pH的高低影响着瘤胃发酵效率和发酵模式[22]。本试验发现，Lys和Met的添加提高了瘤胃pH，这是由于氨基酸的添加使得NH3-N的含量增加，进而使得pH上升。

VFA是反刍动物的主要能量利用形式，是微生物降解饲料的终产物，影响着反刍动物的生长性能和产品特性[23]。目前普遍认为，日粮中的结构性碳水化合物含量越高，乙酸的产量就越高；反之，非结构性碳水化合物含量越高，丙酸含量就更高[23]。本试验发现，添加0.25%的Lys可显著提高乙酸和总挥发性脂肪酸的产量，但继续提高添加量时，并没有显著提高乙酸的产量，反而降低了丙酸的产量；添加0.075%的Met降低了丙酸和总挥发性脂肪酸的产量；这些结果可能是由于限制性氨基酸的添加改变了瘤胃的pH环境，纤维分解菌和淀粉分解菌的活性受到影响，最终使得瘤胃发酵效率和发酵模式发生改变。由于甲烷产量是与乙酸正相关，而与丙酸负相关，因此会出现添加Lys后甲烷产量增加。瘤胃VFA中的支链挥发性脂肪酸（BCVFA）包括异丁酸和异戊酸，本试验发现Glu的添加降低了异丁酸的含量，Met、Arg和Glu的添加降低了异戊酸的含量，这可能是高产奶牛日粮的蛋白质含量（16.9%）已经能够满足奶牛生长和产奶需求，过多的氨基酸补充会降低BCVFA的产量[12]。另一种可能的解释是，瘤胃pH的提高更有利于纤维分解菌的生存，而纤维分解菌的生长繁殖需要BCVFA的供给[24]，因此会使得停留在瘤胃中的BCVFA含量减少。

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结论

① 添加0.25%的Lys可显著提高pH、乙酸和总挥发性脂肪酸的含量，但同时也会显著增加甲烷的产量。

② MFAEI分析表明，在本试验条件下的高产奶牛日粮中，无需额外添加Met和Glu。

参考文献及更多内容详见：

饲料工业，2022，43（19）：47-52