离子交换层析是目前功能最强大,应用最广泛的层析方式。随着科技的发展进步,Cytiva的离子交换填料也在不断推陈出新,面对名目繁多的产品,到底该如何快速选择适合自己的填料呢? 本篇将教大家如何识他们的本质,快速锁定合适的产品。 离子交换填料的选择,一般遵循以下四个步骤 ![]() 离子交换的原理 离子交换层析是根据样品在特定 pH 值的 buffer 中所带电荷的差异,对物质进行分离的一种层析技术。样品所处 buffer 的 pH 值低于其等电点 pI 时,样品带正电,可以与阳离子交换填料上带负电的配基结合;所处 buffer 的 pH 值高于其等电点 pI 时,样品带负电,可以与阴离子交换填料上带正电的配基结合。 对某种样品而言,buffer 的 pH 值与分离方式和效果的关系可通过下图来直观地感受: ![]() 因此对某种样品而言,其适合的离子交换方式与所用的 buffer 的 pH 值息息相关。 01 确定离子交换方式 样品一般在中性 pH 值的环境中保持较好的活性,在进行离子交换层析时,所用 buffer 的 pH 值需偏离样品等电点 1 个 pH 值以上。在交换方式的确定环节,常规选择目标物质结合到填料上,而杂质流穿的模式,洗脱时收集目标物。但也可以选择目标物质为不结合填料的流穿模式,使杂质结合到填料上,同样可以达到目标物质与杂质分离的目的。 所用 buffer pH 值高于样品等电点时,样品带负电,一般用阴离子交换的方式进行物质的分离;所用 buffer 的 pH 值低于样品的等电点时,样品带正电,一般用阳离子交换的方式进行物质的分离。 02 选择配基 离子交换填料由基架和配基组成,填料的性质主要由配基决定。目前Cytiva的离子交换填料上偶联的配基一共有 6 种。
![]() 离子交换填料的配基类型 注:一般首选强的离子交换配基,比如 Q,SP 等。如果样品和待分离物等电点差异较小,可以选择弱的离子交换配基,这样在洗脱电导发生改变的时候,样品与填料的结合力会发生比较明显的改变,从而可以更好地分离结合力(带电量)差异不明显的物质。 03 选择基架 基架的主要差别在于填料粒径大小,从而提供流速和分辨率的差异。离子交换填料基架包括以下三种: ![]() 交联琼脂糖基架:
高流速琼脂糖基架:
![]() 多模式离子交换填料:除了以上普通的离子交换填料外,Cytiva还推出了多模式离子交换填料。这类填料有两种配基—弱阳离子配基 MMC 和强阴离子配基 adhere,分别偶联到粒径为 75μm 和 40μm 的基架上,其中 40μm 的 ImpRes 系列分辨率更高。多模式填料结构和可提供的作用力如下: ![]() Capto MMC & Capto MMC ImpRes:
Capto adhere & Capto Adhere ImpRes:
至此,离子交换填料家族成员全部集齐, 其阵容如下: ![]() 04 根据纯化步骤选择合适的填料 因填料耐受的最大流速不同,分辨率和载量均有差异,同时样品体积和纯度在各纯化步骤中千差万别,需要结合具体的纯化步骤选择合适的填料。 ![]() 1) 捕获 快速富集目的蛋白,将其从大量的杂质或关键污染物如蛋白酶和糖苷酶中分离出来,载量和速度是该步骤的首要考虑因素。该步骤可以使用的离子交换填料类型是 Sepharose FF、Capto、Sepharose XL、Sepharose Big Beads。如果纯化的样品在 mg 级别且后期没有放大需求,可以用 SOURCE 和 Sepharose HP 填料。 2) 中度纯化 去除蛋白、核酸、内毒素和病毒等明显的杂质,重点考虑载量和分辨率。可用填料类型:Sepharose HP、Capto ImpAct、Capto ImpRes、SOURCE 15 、SOURCE 30、Sepharose FF。如果纯化的样品在 mg 级别且后期没有放大需求,可以用 MonoBeads。 3) 精纯 去除痕量杂质,如异构体、核酸、病毒和内毒素等,使目的样品达到应用级别,在这个环节中分辨率最重要。这个步骤可用填料:MonoBeads、SOURCE 15&SOURCE 30、Capto ImpAct、Capto ImpRes和 Capto Hires。 理清以上思路后可以根据样品体积、稳定性等,结合填料载量选出合适的填料及产品类型。 注意事项 选好产品后,在实际的使用中还需要注意以下几个方面:
|
|