引用本文: 晁灵善，阎锡新. 浅谈二代测序技术[J]. 国际呼吸杂志, 2023, 43(1):26. DOI:10.3760/cma.j.cn131368-20221017-00911.
【摘要】病原体宏基因组高通量测序（mNGS）技术为疑难危重症及罕见病原体感染的诊断提供了有效的技术手段。为更好地在重症肺部感染病原诊断领域应用这一技术，基于已发布的专家共识，本文从肺部感染病原诊断思维、mNGS送检适应证、如何提高送检标本质量、重症肺部炎症性疾病mNGS结果解读策略等方面做出述评。2019年全球疾病负担研究显示，下呼吸道感染发病率与病死率居第四位，在感染性疾病中高居首位。新型冠状病毒感染疫情更是使全球陷于严重经济、政治混乱状态。重症肺部感染进展快，病死率高，快速精准的病原体诊断非常重要。传统微生物检测方法（涂片镜检、培养、免疫学方法、PCR）只能检测有限的病原微生物，受检测手段所限，高达50%左右的社区获得性肺炎难以明确诊断。病原体宏基因组高通量测序（mNGS），，是指采用高通量测序技术对送检样本中所有核酸进行测序，并通过生物信息学分析判断样本中是否存在病原体相关基因的检测方法。与传统基于分离培养的病原体检测技术相比，该技术从理论上能够无偏倚地检测各类微生物，包括难以培养的病原体以及新发病原体。
mNGS技术是一个开放的分析和诊断系统，所检测的病原体数量高达近万种，为疑难危重症及罕见病原体感染的诊断提供了有效的技术手段。越来越多的临床研究及特殊病原体感染案例报道肯定了mNGS在感染性疾病病原学诊断中的价值。与无菌体液和组织标本不同，因呼吸道存在病原体定植，取材过程中定植菌污染难以避免，而mNGS无偏向性的病原体基因检测难以鉴别污染、定植与感染状态，虽然国内已发表多个包括呼吸系统感染在内的mNGS专家共识，主要针对检出病原流行病学意义进行分析，临床如何应用mNGS、mNGS适应证、标本送检规范、生物信息分析等没有统一标准。为提高mNGS在呼吸道感染中的应用价值，作者拟结合专家共识，从临床角度谈谈对mNGS技术的初浅认识。病原学诊断仍然是重症社区获得性肺炎（community acquired pneumonia, CAP）重要桃战。在拟采用mNGS技术前，首先应缜密分析，做出CAP初步诊断，评估常规微生物检测技术的可行性，然后才可以考虑是否应用mNGS。注意重症CAP与非感染性间质性肺疾病、肺水肿、肺不张、肺栓塞、过敏性肺泡炎及肺血管炎等非感染病因进行鉴别。对于首先考虑非感染性病因导致的肺部病变，尽量避免mNGS滥用。计划应用mNGS时，结合患者年龄、基础疾病和危险因素、症状或体征、胸部影像学（特别是胸部CT）特点、CAP病情严重程度、既往抗菌药物效果等，结合病变部位、性质、机体耐受程度综合分析，选择合适的标本采集与微生物检测方法。如考虑常见细菌性感染，传统微生物鉴定方法多数能满足临床需求，而弥漫性病变首选支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid, BALF），胸膜下病变首选经皮肺针吸活检，中央气道周围病变可以经支气管镜针吸活检术（transbronchial needle aspiration, TBNA）和/或经支气管镜肺活检术（transbronchial lung biopsy, TBLB）。重症或难治性肺部感染病原学研判时，根据胸部影像学特点应用针对性取材方式获取呼吸道或肺部标本。如果再用好mNGS技术，肺部感染诊断与治疗水平便会有显著提高。具体建议如下：
如果患者有免疫功能受损（长期使用糖皮质激素、肝肾疾病、糖尿病等），起病较急，有发热等感染症状，应首先除外病毒（特别是流感病毒/巨细胞病毒/腺病毒）、耶氏肺孢子菌（pneumocystis jiroveci, PJ）等感染。只要患者病情允许，应尽快行BALF-mNGS，特别是重危患者及免疫功能低下患者。致病微生物未必只有一种病原体，病毒与真菌共感染情况并非少见，如：耶氏肺孢子菌/巨细胞病毒，曲霉/巨细胞病毒或耶氏肺孢子菌/曲霉共感染等，此时mNGS更有优势。起病隐袭、亚急性或慢性发病，而发热等中毒症状不明显时，应首先行自身抗体等相关检查，除外结缔组织病相关性间质性肺炎、过敏性肺泡炎、肺血管炎等非感染性间质性肺疾病，此时BALF-mNGS病原学阴性有助于间质性肺疾病鉴别诊断。可以说，目前病原学mNGS对呼吸危重症的最大贡献就是弥漫性肺部感染病原诊断与间质性肺疾病的排除诊断。胸部影像学提示多发团片状病变或者伴有空洞时，应首先考虑化脓菌感染或侵袭性肺曲霉病。有脓性或脓血性痰液应尽快涂片，常能发现致病菌，同步行细菌、真菌培养。条件允许应尽早行支气管镜检查，以获取支气管肺感染证据，包括侵袭性支气管-肺曲霉病、化脓性支气管肺炎等。如有胸腔积液、脓毒败血症时应同步进行体液培养。培养阴性时再考虑采用mNGS进一步检测。对于局部难治性或复发性肺部病变，首先结合治疗反应与病变进展研判肿瘤、局限性机化性肺炎、肉芽肿性血管炎与特殊病原感染（隐球菌、曲霉、毛霉、非结核分枝杆菌等）。临床上，除了新型隐球菌肺感染、肉芽肿性血管炎外，上述几种比较顽固的局部感染的胸部CT易呈现无液平空洞。气管镜检查与灌洗、经皮穿刺活检同步送检mNGS，结合病理学检查能明显提高诊断率。总之，在二代甚至三代测序时代，应尽量缩短并减少经验性抗感染治疗的时间，把握时机获取下呼吸道有效标本，在传统微生物检测基础上，用好包括mNGS在内的分子生物学技术，在综合分析条件下，提高肺部感染性疾病精准治疗水平。综合国内专家建议，mNGS送检适应证如下：
（1）疑似下呼吸道感染的危重症患者，存在继发或并发危及生命的严重感染，疾病进展迅速，病情危重，伴有全身多器官功能受损时，在常规病原检查基础上，开展mNGS病原检查。 （2）免疫功能抑制患者的呼吸系统感染，为了缩短经验治疗时间，应尽早送检mNGS以发现复杂条件致病菌。注意该类患者呼吸道易出现各种细菌与真菌定植，必须结合临床与影像特点对mNGS检出的病原体加以甄别，不能盲目全覆盖。通常该类患者生物信息分析难度较大。 （3）疑似慢性肺部感染或难治性感染，且既往治疗效果不佳时，建议送检mNGS。因反复抗感染治疗，多数存在呼吸道病原体定植，送检标本尽量选择肺穿刺活检标本等无菌组织，避免呼吸道定植病原体污染干扰，同时进行其他相关检查与非感染性病原进行鉴别。 （4）疑似呼吸道感染暴发且病原体不明，建议送检mNGS。 （5）通过有创性操作获取的组织标本，如经皮肺穿刺组织、TBLB/TBNA等，建议送检mNGS。 （6）怀疑厌氧菌引起的肺脓肿、坏死性肺炎或其他肺部感染，建议采集避免口腔菌群污染的标本（如下呼吸道标本、经皮穿刺肺活检组织及胸腔积液），送检mNGS可提高厌氧菌检出率，如常规抗感染无效时可考虑送检mNGS。对怀疑感染的肺部弥漫性病变，建议首选BALF送检，第二次灌洗回收液含宿主背景菌更少；若无法耐受气管镜检查，建议选择诱导痰、咳痰或者经上呼吸道吸痰标本；怀疑病毒性下呼吸道感染者，建议同时行DNA+RNA检测，若无法获得下呼吸道标本，可采集鼻咽拭子或外周血送检mNGS；对于肺部外周性病灶、局限性病灶或纵隔、纵隔/肺门淋巴结肿大，应根据病灶的特点，个体化选择有创性操作方式获取组织送检；疑似肺部感染而无法取得呼吸道标本，如可疑粟粒性肺结核、血源性多发性肺脓肿早期等，可以送检外周血；如果肺部病灶疑似为全身疾病所累及，可以同步送检其他相应部位标本。呼吸道标本mNGS病原检测的最大问题是定植菌、宿主背景菌干扰。标本污染后因建库时对DNA扩增而使污染被放大，使测序结果解释更加困难。因此在临床标本采集过程中严格无菌操作、减少污染很重要。用于mNGS检测的RNA测序标本需添加核酸稳定剂。mNGS标本的运输需防污染、防振荡、冷链快速运送，如不能及时送检，应保存于-70°C冰箱或液氮。临床怀疑分枝杆菌、真菌等病原体感染时，常规核酸提取方法难以保证核酸提取的质量，需使用特殊破壁方法，但目前尚无标准化方案。由于呼吸道标本宿主细胞DNA含量较高，不去除宿主信息会造成测序结果大部分来自人基因组，而病原微生物基因组序列相对较少，故需在核酸提取过程中去除宿主细胞或核酸。因此，有些实验室使用'cell free'的方法处理标本，旨在减少背景基因于扰；新出现的病原体靶向测序技术（targeted next generation sequencing, tNGS）则针对致病性较强的优势菌进行扩增，再行mNGS，提高致病性较强微生物基因比率，具有病原体范围明确、测序成本低等优势。
虽然mNGS技术相对于传统病原学检测技术具有敏感性优势，但是由于受污染菌、宿主背景基因影响，阳性结果不宜直接作为肺部感染诊断依据，必须结合患者病史、胸部影像学特征、治疗反应、免疫状态等综合分析，并与传统病原学检测技术相结合，各类检测报告相互交叉印证。下呼吸道标本mNGS检测结果解读建议：
（1）临床-检验-影像结果综合分析、交叉验证。本着“临床思维引导诊断、临床检验验证思维”的逻辑，综合分析，反复研判。也就是首先考虑感染，然后确定是否为感染。（2）结合检出微生物的临床致病性、流行病学特征、特异性序列数级相对丰度判断其为致病菌、定植菌还是背景菌。①定植菌：如草绿色链球菌、奈瑟菌属、嗜血杆菌属、普雷沃菌属、韦荣球菌属、罗氏菌属、凝固酶阴性葡萄球菌、肠球菌属、念珠菌属等，考虑定植可能大。同样，痰液检出大量口腔厌氧菌，需结合患者的病史、标本类型，必要时结合文献资料综合判读。例如肺部弥漫性病变的免疫功能低下患者即使BALF检出厌氧菌也应该首先考虑污染或定植菌；相反，如果从肺部空洞样病变检出的厌氧菌则应考虑肺脓肿，无论是原发性还是继发性肺脓肿。②优势致病菌：若痰标本或BALF检出不存在或很少存在于口腔的病原体，如嗜肺军团菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、百日咳博德特氏菌、白喉棒状杆菌等，考虑致病微生物可能性大。如果再有某些相应病原学感染特征则可以指导治疗，否则应进一步获取感染证据，包括定向PCR检测、血清学等。③特殊病原：如临床怀疑结核感染，即使序列数极少，仍需考虑其力致病微生物的可能；而mNGS检测阴性，也不能除外结核感染。若呼吸道标本检出非结核分枝杆菌，需结合所检出分枝杆菌属排名情况及种的类别，如常见致病的鸟胞分枝杆菌复合群、脓肿分枝杆菌复合群、堪萨斯分枝杆菌，考虑其为致病微生物的可能。应结合影像学表现、必要的血清学、PCR等结果综合判断是否予以针对性治疗。④条件致病菌：下呼吸道标本检出隐球菌属、曲霉属、毛霉属及其他丝状真菌，更需要结合患者免疫状况、基础疾病（特别是糖尿病、慢性肝肾疾病、长期糖皮质激素治疗等）、胸部影像、既往抗菌药物治疗效果以及检出病原序列数综合分析。如果检出序列数较低，且无感染临床迹象，应进一步查BALF标本半乳甘露聚糖抗原试验（GM试验）、真菌培养进行验证或经皮肺组织穿刺进行病原学与组织病理学检查验证。⑤高致病菌：mNGS如检出高传染性或高致病性病原体，无论特异性序列数多少都应充分重视，需对检测结果进行复核以及使用其他检测技术验证。呼吸道标本若检出环境中广泛存在的微生物，而且抗菌药物能够覆盖，需考虑标本处理过程中的污染。⑥长期住院患者：长期住院或机械通气患者，下呼吸道检出院内感染常见病原体基因，如鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌及嗜麦芽窄食单胞菌等条件致病菌，必须首先除外定植菌。需要将检出序列数、相对丰度与传统病原检查结果、肺部感染评分、影像学结果综合考虑是否为致病微生物，对于全身感染中毒症状重者，若与血标本结果一致更有临床价值。但原则上不建议通过mNGS诊断医院获得性肺炎。⑦免疫功能抑制患者。此类患者下呼吸道检出的低毒力病原体，需首先考虑致病微生物可能，不应轻易除外感染。（3）单一标本无法判定是否致病微生物，有条件时可结合多个不同类型标本的检测结果综合判断。如下呼吸道分泌物、胸腔积液、血液、组织病理等，特别是重症肺炎多器官受累患者。 mNGS始创于国外，盛行于国内。虽然核心技术相同，但开发者在某些技术环节有些改良优化，室间标准差异很大。2022年《全国下呼吸递感染宏基因组（DNA和RNA）高通量测序室间质量评价预研活动结果报告》中提到131家参评单位，合格率为41.8%。漏检率高者集中在呼吸道RNA病毒。各实验室的微生物破壁方式、DNA和RNA提取、富集、文库制备、测序平台、微生物比对算法、公共数据库和背景微生物数据库等均有较大不同；特别是在样本前处理、核酸提取、测序到生物信息分析环节差异较大。理论上来讲，背景基因少、读长高、基因库完整敏感性高。但限于目前对阳性基因宿主病原致病状态缺乏辨认方法，最终还是要结合临床其他资料综合研判其意义。这是开发者努力的方向，也符合临床思维引领诊断的必然规律。
目前呼吸道病原mNGS检测是把双刃剑。对于常规容易培养的病原菌的检测并无优势，甚至使临床医师更加纠结。对于少见病原体、难以培养或无法培养的病原体（病毒、非典型病原体）、新发病原体发现有其优势，甚至有拨云见日之感。mNGS步骤繁多，影响因素颇多，目前急需标准化；其结果解读应结合患者临床表现、其他微生物学检测，由临床医师、临床微生物医师共同解读，通过“会诊”能提高正确判断概率。当然更期待该项技术日臻完善。比如tNGS的使用大量针对目标病原体，乃至病原体上特定基因的引物，对待测样品中抽提出的核酸进行超多重PCR扩增，进而获得多种针对扩增靶标的产物，再通过高通量测序仪对这些扩增产物进行同步定量分析。tNGS很好地结合了PCR检测的高敏感度以及测序反应的高特异度，可以对预设的病原体进行快速、精准识别。同时tNGS在测序过程中加入已知浓度的合成人源序列核酸作为内参，使得不同批次的样本可以通过内参作为桥梁进而进行半定量和比较，解决了mNGS技术难以进行样本间病原浓度横向比较的问题，从而可以进行临床动态监测。利用tNGS技术对呼吸道相关的病原体，比如肺炎进行筛查，可以辅助解决肺炎病原学诊断的难题，具有很大的临床意义。
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