冠状动脉粥样硬化性心脏病患者心外膜脂肪组织的生物信息学研究

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）导致的心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）是全球死亡的主要原因，世界卫生组织预测2030年将有2 360万人死于CVD[1]。AS形成机制复杂，主要涉及血管内皮损伤、单核巨噬细胞黏附、脂质沉积等[2]，但这些因素如何影响AS进程，其机制尚未完全清楚。因此找寻AS新的诊断靶点，预防AS的发生，延缓其进展尤为重要。利用基因芯片技术对临床患者标本进行检测分析，筛选出一些具有价值的基因，进而深入研究冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary artery disease，CAD）的发病机制具有重要的临床意义。肥胖是CVD的独立危险因素，但肥胖的主要评价指标体质指数（BMI）与AS患者死亡率呈'U'型关联，这种现象被称为肥胖悖论，因此脂肪组织不再被认为是单纯的'能量仓库'，而是一种代谢活跃的内分泌和旁分泌器官[3]。心外膜脂肪组织（epicardial adipose tissue，EAT）在解剖上与冠状动脉紧密相连，同AS、心房颤动、心力衰竭等CVD密切相关[4,5,6]。多项研究发现功能失调的EAT通过分泌外泌体（exosome，EXO）和生物活性物质促进AS疾病进展[7]，但其作用机制仍需进一步研究。本研究通过对美国国家生物技术信息中心（NCBI）的基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus database，GEO）中CAD患者EAT和EXO的基因测序数据进行生物信息学分析，探讨EAT参与AS的分子机制及其与EXO的联系，旨在为CAD的诊断和治疗提供新的理论基础。

1　材料与方法

1.1　数据集的下载与预处理

以'epicardial adipose tissue OR EAT'为关键词，选择'Homo sapiens'为研究对象检索GEO数据库，根据数据集提供的相关信息，获得所需芯片GSE64554、GSE120774，根据临床信息将EAT的测序数据分为CAD组和健康对照组。下载series matrix的数据，采用'sva'包'ComBat'方法去除批次效应，合并基因表达矩阵。通过exoRBase 2.0数据库获取CAD组与健康对照组血液EXO基因表达谱。

1.2　差异基因的筛选

通过'limma'R语言包[8]对合并后数据集中CAD组与健康对照组EAT间差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）和CAD组与健康对照组EXO间DEGs进行筛选，以P<0.05为筛选条件，并将结果可视化为火山图和热图。

1.3　加权基因共表达网络（WGCNA）的构建与CAD相关模块的识别

为了防止合并数据集对基因关联度的影响，使用'WGCNA'R语言包构建GSE64554数据集基因共表达网络并识别出模块。选择满足无尺度网络的标准软阈值β构建基因共表达网络，转化拓扑重叠矩阵（topological overlap matrix，TOM），采用动态剪枝法对模块进行初步划分。根据GSE64554数据集样本临床信息，决定纳入的临床信息包括疾病和年龄，得到相关性最高的模块进行后续分析。计算基因与模块的相关系数（module membership，MM）来评估基因与模块之间的相关性，以|MM|>0.8筛选模块内枢纽基因（hub gene）。

1.4　基因功能的富集分析

通过'clusterProfiler'R语言包[9]将所获基因进行富集分析，以FDR<0.05为筛选标准，进行通路富集分析。通过GO富集分析，得到所选基因所富集的生物过程（biological process，BP）、细胞组分（cellular components，CC）及分子功能（molecular function，MF）。通过KEGG通路富集分析，得到所选基因所富集的信号通路。将所获基因导入Metascape在线数据库[10]进行基因的富集分析以及转录因子预测。

1.5　蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络的构建与hub基因筛选

将所选基因导入STRING数据库（https://）构建PPI网络，将PPI网络导入Cytoscape（Version 3.9.0）软件[11]通过CytoHubba插件MCC算法获得连接度最高的10个基因作为关键基因，并进行绘图。

1.6　免疫细胞浸润分析

在Cibersort网站（
https://cibersort./）下载22种免疫细胞的基因表达矩阵，采用Cibersort反卷积算法，计算GSE64554芯片中46个样本的免疫细胞浸润情况，并作图对组织的免疫细胞浸润情况进行比较。

1.7　临床样本的采集及实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）

选取山西医科大学第二医院2021年6—10月行冠状动脉造影患者20例，其中CAD患者及健康者各10例，留取外周血储存在-80 ℃冰箱中备用。引物由武汉赛维尔生物科技有限公司合成，见表1。按照总RNA快速提取试剂盒（RP4001，百泰克公司）的说明提取血浆中的总RNA，cDNA的合成按照HiScriptⅢ RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）试剂盒的步骤进行，第一步去除总RNA中残余的DNA，第二步反转录cDNA，得到的cDNA保存于-20 ℃冰箱。以cDNA为模板，进行qRT-PCR，反应程序为：95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s；60 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，40个循环；95 ℃15 s，65 ℃ 5 s，95 ℃ 50 s。结果用2-ΔΔCT进行计算分析。

1.8　统计学方法

采用Excel对录入整理数据，应用SPSS 26.0软件对数据进行统计学分析，符合正态分布的连续变量采用（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　CAD组与健康对照组EAT间的DEGs

2.1.1　DEGs的获取

采用'limma'包获取CAD组与健康对照组EAT间DEGs，以P<0.05作为筛选差异基因的阈值，得到差异表达的1 511个mRNA，其中表达上调956个，表达下调555个，见图1、图2。

2.1.2　EAT间DEGs的GO/KEGG富集分析与PPI网络

对合并后CAD组较健康对照组EAT间DEGs进行GO富集分析，共获得符合筛选条件的GO术语共800条，其中BP 567条，主要涉及细胞压力反应、细胞DNA损伤刺激反应等。获得CC 127条，主要涉及细胞质基质、MHC蛋白复合物、内质网腔侧的组成部分等。获得MF 106条，主要涉及MHCⅡ类蛋白复合物、特殊核糖核酸酶激活等，见图3。共富集到KEGG通路20个，主要涉及RNA降解、病毒性心肌炎、移植物抗宿主病、1型糖尿病等信号通路，见图4。

将所获EAT间DEGs输入STRING数据库，构建PPI网络，其中实际上有互作关系的节点有1 507个，有1 258条边，每个节点的平均Degree为1.67分。将PPI网络图导入Cytoscape软件，使用CytoHubba插件根据MCC算法得到连接度前10的基因并作图，分别为RPS27A、PSME4、PSMA1、PSMA5、GLI3、GLI1、PSME2、PSMB9、SUFU和SHH，见图5。

2.1.3　EAT间DEGs的Metascape富集分析

对合并后CAD组与健康对照组EAT间DEGs进行Metascape富集分析，发现DEGs主要富集于嗅觉转导、细胞对DNA损伤刺激反应、单纯疱疹病毒1型感染、RNA代谢、调节细胞对压力的反应、适应性免疫系统等，TRRUST数据库预测MHCⅡ反式激活蛋白（CIITA）转录因子可能参与了EAT间DEGs的调控，见图6、图7。

2.2　EAT组织的WGCNA分析

2.2.1　EAT组织WGCNA软阈值的选择与模块的初步划分

本研究最终以β=5作为软阈值来构建共表达网络，设置每个基因模块中基因数目最小为30，设定基因的聚类高度上限为0.995。最终得到156个网络模块，模块中的基因个数为30~2 169。根据拓扑重叠程度，制作模块相关性图，见图8、图9。

2.2.2　临床信息关联与hub基因的获取

将各个划分出的模块与临床信息进行关联分析，得到与AS患者的EAT样本临床信息最为相关的模块进行后续研究。结果发现，AS患者EAT与green4（r=0.50，P=0.02）、slateblue（r=0.54，P=8.0×10-3）、darkseagreen4（r=0.55，P=6.4×10-3）、darkolivegreen1（r=0.55，P=7.0×10-3）、sienna4（r=0.56，P=5.6×10-3）、brown3（r=0.57，P=4.2×10-3）模块呈正相关，与deeppink（r=0.50，P=0.01）、lavender（r=0.60，P=2.6×10-3）、lavenderblush3（r=0.56，P=5.9×10-3）呈负相关，以|MM|>0.8筛选所选模块内hub基因，见图10。

2.3　关键基因的获得

将DEGs同模块内hub基因取交集，获得差异表达的模块内hub基因，将其作为EAT组织参与AS病理生理过程的关键基因，其中上调hub基因为DDX47、FEM1C、NOL11、SRP54、ABI1、PATL1、BNIP2，下调hub基因为C1orf159、CHCHD4，见图11。

2.4　免疫细胞浸润分析

通过Cibersort反卷积算法，计算GSE64554芯片中CAD组和健康对照组EAT的免疫细胞浸润情况。研究发现，CAD组EAT组织较健康对照组中初始CD4+ T细胞表达丰度升高（P=0.048），静息树突细胞表达丰度减低（P=0.044），见图12、图13。

2.5　CAD组与健康对照组EXO间DEGs

采用'limma'包选获取CAD组与健康对照组EXO间DEGs，以P<0.05，|logFoldchange|>1作为筛选差异基因的阈值，共得到DEGs 1 658个，其中上调278个，下调1 380个，见图14、图15。

2.6　EAT来源EXO

将CAD组与健康对照组EAT、EXO间DEGs取交集并做Venn图，共获得129个基因，其中上调16个，下调113个，经筛选，将BPI、BIRC5、CXCL12、RNASE1、F2R作为关键基因并通过qRT-PCR进行验证，见图16。

2.7　EAT来源EXO间DEGs的验证

收集CAD组和健康对照组外周血，运用qRT-PCR验证生物信息学分析所得的EAT来源EXO基因BPI、BIRC5、CXCL12、RNASE1、F2R的mRNA水平。结果显示，与健康对照组相比，CAD患者的5个所选基因的表达水平差异有统计学意义（P<0.05），其中BPI、BIRC5、CXCL12和RNASE1的mRNA水平升高，F2R基因的mRNA水平下降（P<0.05），见表2。

3　讨论

EAT作为一种特殊的脂肪组织，解剖结构上紧贴冠状动脉，在病理环境中其向炎症表型转化，通过分泌促炎细胞因子和EXO参与血管内皮损伤、血管重塑、免疫细胞黏附等AS病理生理过程。EAT的炎性反应是AS的全新诊断治疗靶点[5]，OIKONOMOU等[12]通过影像组学技术将心外膜脂肪衰减系数（fat attenuation index，FAI）应用于CAD患者的早期筛查，而目前已广泛应用于临床的钠-葡萄糖协同转运蛋白2（sodium-dependent glucose transporters 2，SGLT-2）抑制剂达格列净则可以通过减轻EAT炎症而减少糖尿病患者心血管事件的发生率[13]，但EAT在CAD中的作用机制仍需进一步研究。

此次通过生物信息学分析的方法从数据集GSE64554和GSE120774中筛选出CAD组和健康对照组EAT间DEGs 1 511个，通过富集分析发现DEGs主要富集于细胞质基质、MHC蛋白复合物、MHCⅡ蛋白复合物、RNA降解、抗原加工和呈递等。目前AS被认为是一种慢性炎症性疾病，MCHⅡ作为T细胞的呈递抗原，通过抗原识别、细胞活化、产生细胞因子等方式在炎症过程和CAD进展中发挥作用[14]。通过Meatscape富集分析中的TRRUST数据库，笔者预测到CIITA转录因子可能在EAT中发挥了重要的调节作用。研究发现，CIITA通过其转录后修饰甲基化[15]、去乙酰化[16,17]调节MHCⅡ的转录而参与AS。通过免疫细胞浸润分析本研究发现CAD患者EAT中幼稚CD4+ T细胞丰度升高，早在2015年IBORRA等[18]便指出可以通过观察幼稚CD4+ T细胞的体外分化程度评估AS程度，GADDIS等[19]指出AS通过影响糖酵解而损害幼稚CD4+ T细胞功能。综上所述，MHCⅡ在AS中发挥了重要作用，但其在CAD患者EAT中的作用和调控机制仍需进一步研究。

通过筛选CAD患者与健康对照组EAT间DEGs，构建EAT组织WGCNA，获得了DDX47、FEM1C、NOL11、SRP54、ABI1、PATL1、BNIP2、C1orf159、CHCHD4、RPS27A共10个基因作为EAT参与CAD病理生理过程的关键基因。目前仅有关键基因被发现在CVD中发挥作用，XIA等[20]通过生物信息学技术发现免疫相关基因RPS27A可能参与AS的病理过程，HUANG等[21]指出RPS27A基因在糖尿病视网膜病变的关键基因且同幼稚CD4+ T细胞密切相关。LI等[22]发现MBNL1通过对ABI1的剪切调控AS中平滑肌细胞的表型转换。因此，关键基因仍需进一步进行细胞和动物实验证明其在EAT中的差异表达以及相关功能。

内皮细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、脂肪细胞和血小板来源的EXO通过转运蛋白质、RNA、DNA和其他生物活性物质在缺血再灌注损伤、血管钙化、AS和心脏重塑中发挥了重要作用，已成为CAD的全新诊断治疗靶点[23]。脂肪组织是循环中EXO的来源之一[24]，冠状动脉血管周围脂肪组织是一种特殊的EAT[25]，LIU等[26]发现血管周围脂肪组织来源EXO中miR-382-5p通过ABCA1/ABCG1信号通路调节泡沫巨噬细胞形成。LI等[27]发现血管周围脂肪组织来源EXO中miR-221-3p通过介导血管重塑参与AS。ZHAO等[7]发现芒果苷诱导血管周围脂肪组织衍生的EXO可以改善AS中的内皮功能障碍，因此EAT来源EXO在AS中的作用具有重要的研究价值。

为进一步探讨EAT在CAD中的作用机制，本研究将CAD患者与健康对照组的EAT间DEGs、EXO间DEGs取交集，共获得129个基因，并筛选表达程度较高、有意义的基因RNASE1、BPI、BIRC5、CXCL12、F2R。其中前４个基因为CAD患者中上调基因。RNASE1是一种可分泌的耐热蛋白，具有强大的心脏保护功能[28]，其通过保护内皮细胞在炎症中的损伤而成为血管稳态的关键调控者[29]，在CAD中，EAT可能通过EXO释放RNASE1进而调节冠状动脉内皮细胞的炎性损伤。血管生成趋化因子介导细胞趋化、白细胞脱粒和血管生成，CXCL-12同AS密切相关[30]，其通过CXCL-12-CXCR4轴参与平滑肌细胞表型转化保护血管稳态[31]，特异性过表达巨噬细胞IGF-1通过减少CXCL-12介导的单核细胞募集和增加ABCA1依赖性巨噬细胞脂质外流增加AS斑块的稳定性[32]，但目前尚无关于EXO内CXCL-12的相关研究。BIRC5是凋亡抑制蛋白（IAP）家族的成员，LI等[33]通过对小鼠颈动脉单细胞测序发现BIRC5可能与血流紊乱所致血管巨噬细胞聚集相关。早在2002年便有报道指出BPI的单核苷酸多态性同心肌梗死密切相关[34]，BLEIJERVELD等[35]通过循环中粒细胞的深度蛋白质组分析发现了BPI可以作为严重AS性冠状动脉狭窄的生物标志物，这表明BPI可以作为晚期CAD乃至预测急性心血管事件的标志物。F2R是血管壁炎症和血栓形成的关键调节剂，其多态性同氯吡格雷疗效密切相关[36]，但目前少有F2R在AS中的研究。

综上所述，本研究共确定了DDX47、FEM1C、NOL11、SRP54、ABI1、PATL1、BNIP2、C1orf159、CHCHD4、RPS27A共10个关键基因，RNASE1、BPI、BIRC5、CXCL12、F2R共5个可能源自EAT EXO的基因进行了验证，证明其在CAD中的诊疗意义，此外还探讨了CAD患者EAT免疫浸润情况，为CAD的基础研究提供理论支持。本研究有其局限性，本研究主要针对mRNA，但蛋白质才是生命活动的执行者，mRNA层面的改变并不能等同蛋白质层面的改变，因此本研究所得结论仍需动物、细胞实验进一步验证。

本文无利益冲突。

参考文献略