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题目：Biofortified tomatoes provide a new route to vitamin D sufficiency 刊名：nature plants（brief communications) 作者：Jie Li, Cathie Martin et al 单位：Norwich Research Park, Norwich, UK 日期：23 May 2022    01 摘要  维生素 D 状况不佳是一个全球性的健康问题；不足会导致更高的癌症风险、神经认知能力下降和全因死亡率。大多数食物含有很少的维生素 D，而植物是非常贫乏的来源。我们通过基因组编辑设计了番茄中维生素原 D 3的积累，修改了茄科植物中植物甾醇生物合成的复制部分，以提供一种生物强化食品，增加了从废料中生产补充剂的可能性。 02 技术路线  番茄（Solanum lycopersicum）cv。Sl7-DR2的 Money Maker 和敲除突变体在平均环境温度为 20-22 °C 的温室中生长。 选择Sl7-DR2 ( Solyc06g074090 ) 基因外显子 2 中的两个特定目标序列（图1b ）以生成Sl7-DR2敲除突变体。 番茄稳定转化 Sl7-DR2基因敲除品系的筛选 RT-qPCR 分析 MALDI-成像分析 甾醇分析 SGA分析 紫外线处理 03 主要结果 3.1 维生素 D 维生素 D 可预防影响骨骼发育的缺乏症并转化为具有类固醇激素生物活性的产物，其在包括大脑在内的许多器官中发挥信号传导作用。因此，维生素 D 缺乏会影响免疫功能和炎症，并与微量营养素缺乏症、癌症、帕金森病、抑郁症、神经认知能力下降、痴呆症和 2019 年冠状病毒病 (COVID-19) 的增加有关感染风险。 维生素 D 可由 7-脱氢胆固醇 (7-DHC)（也称为维生素 D 3 ）中合成，但主要来源是饮食。全世界大约有 10 亿人患有维生素 D 不足，而且这个数字还在增加，这主要是因为膳食供应不足。我们在植物中开发了一种新的维生素 D 饮食来源，以满足对解决维生素 D 不足的方法日益增长的需求，这与那些采用富含植物、素食或纯素饮食的人息息相关。 最初对植物中维生素 D 2的鉴定最终证明是由于真菌感染。7-DHC 由一些植物合成，例如番茄，主要在叶子中合成胆固醇和甾体配糖生物碱 (SGA)。番茄叶子的 UVB 暴露产生维生素 D 3。然而，植物通常不是维生素 D 3的膳食来源，最好的是鱼和奶制品。暴露于 UVB 光后，蘑菇和酵母可用作维生素 D 2的来源，但据报道，在几项流行病学研究中，维生素 D 2的生物有效性大大低于维生素 D3。 尽管已在番茄叶片中鉴定出 7-DHC，但它通常不会在果实中积累，它在果实中充当 SGA 形成的中间体：绿色果实中的番茄素和成熟果实中的七叶苷。最近已经表明，重复途径在包括番茄在内的茄科物种中起作用，其中一些酶的特定同种型通常负责植物甾醇和油菜素类固醇的生物合成，产生胆固醇以形成 SGAs（图1a )。植物甾醇和胆固醇生物合成的这种部分分离允许合成重要激素（油菜素内酯）和更特殊的应激化学物质（如 SGA）的代谢灵活性，这些化学物质具有杀真菌、抗菌和杀虫的特性。 番茄中 SGA 生物合成的“重复”途径的存在使得 7-DHC 积累的工程相对简单。7-脱氢胆固醇还原酶 (Sl7-DR2) 的特定亚型将 7-DHC 转化为胆固醇，用于在叶子和果实中合成 α-番茄碱（图1a )。因此，敲除 Sl7-DR2 的活性应该会导致 7-DHC 的积累，而对植物甾醇和油菜素类固醇生物合成的影响最小。
3.2 生成生物强化番茄 为了生物强化番茄维生素原 D 3，我们测试了使用成簇规律间隔的短回文重复序列-CRISPR 相关蛋白 9 (CRISPR-Cas9) 基因组编辑阻断 Sl7-DR2 活性以提高 7-DHC 水平的功效。两个单向导 RNA (sgRNA) 被设计用于Sl7-DR2基因第二个外显子内的序列（图1b），sgRNA 与番茄中唯一的其他甾醇 Δ 7还原酶基因 ( Sl7-DR1 )之间的同源性最小。我们恢复了Sl7-DR2的五个独立敲除等位基因T1 代内的基因，其中三个在两个 sgRNA（MUT#1、MUT#2 和 MUT#3）之间携带相同的外显子 2 序列 108 bp 缺失。另外两个敲除等位基因是通过删除 2 bp 并插入 1 bp (MUT#5) 或通过仅在第二个外显子 (MUT#4) 中插入 1 bp 创建的，这两者都会导致移码并预测过早终止Sl7-DR2蛋白（图1b）。在 T1 代中回收了纯合子敲除等位基因，并且在 T2 代内的五个品系中的四个品系中回收了缺少携带Cas9基因和 sgRNA 序列的转移 DNA (T-DNA) 的纯合子敲除品系。 在分离后，在 T2 代中选择了Sl7-DR2的五个纯合敲除等位基因。在这些突变系中未检测到Sl7-DR1基因的脱靶编辑（补充图3）。使用液相色谱-质谱 (LC-MS) 13、17分析果实和叶子的7-DHC 含量以及其他植物甾醇、胆固醇和 SGA 的水平。 3.3 生物强化番茄的生理特性 Sl7-DR2 活性的丧失对番茄品系的生长、发育或产量没有影响。这与拟南芥( DWARF5 )中参与植物甾醇生物合成的甾醇 Δ 7还原酶编码基因的功能丧失突变的表型形成对比，后者由于油菜素类固醇生物合成的抑制而相形见绌。 通过比较野生型和编辑品系叶片中豆甾醇的水平，证实了Sl7-DR2突变对植物甾醇代谢缺乏影响，豆甾醇是番茄植物甾醇途径的最终产物 以及果实和叶子中的其他植物甾醇。在野生型植物中，7-DHC 仅在未成熟的绿色果实中检测到，在成熟和成熟的果实中检测不到。相反，Sl7-DR2 活性的丧失导致叶子和绿色果实中 7-DHC 水平的显着增加（图1c，d）。7-DHC 的水平在Sl7-DR2突变体的成熟果实中较低（图1c），但仍然足够高，如果通过 UVB 处理转化为维生素 D 3，一个番茄中的含量将相当于两个番茄中的含量中等大小的鸡蛋或 28 克金枪鱼，它们都是维生素 D 的推荐膳食来源（美国农业部食品数据中心，https://fdc.nal./). 对于 7-DHC 水平下降的老年人，食用经过 7-DHC 生物强化的水果可能会直接解决他们的不足。 3.4 番茄果肉和果皮中7-DHC 增加 基质辅助激光解吸/电离 (MALDI) 成像显示 7-DHC 的增加分布在番茄的果肉和果皮中（图 2a ）。α-番茄碱和脱氢番茄碱在果实成熟过程中分别转化为七叶皂苷 A 和脱氢七叶苷 A，这意味着成熟果实中的番茄碱含量降至较低水平。突变体和野生型绿色果实的 MALDI 成像表明，α-番茄碱在Sl7-DR2突变体中的含量低于对照（图2a），并且叶片在突变体中的水平显着降低，尽管α-番茄碱未被消除（图2b)。
与对照相比，在突变体的成熟果实中也观察到 SGA 七叶苷 A 水平的强烈降低（图2c）。α-番茄碱的减少可能被认为是有益的，因为据报道它具有毒性/抗营养活性。有趣的是，果实（图2a）和叶子（图2d）的胆固醇水平普遍高于野生型对照). 这表明沿 SGA 生物合成途径的通量阻断可以通过增加中间体通量来补偿，可能由植物甾醇途径（或至少 Sl7-DR1）的酶催化，补充胆固醇产生并限制 SGA 积累的减少。然而，这不涉及任一途径中编码酶的基因表达的补偿性变化，如野生型和突变系叶片中这些基因的逆转录定量 PCR (RT-qPCR) 分析所示。只有植物甾醇途径中的SlC5-SD1显示出比对照始终更低（~30％）的转录物水平（图1a）。
作为对我们的生物强化策略的重要确认，我们测试了Sl7-DR2突变植物中升高的 7-DHC 水平是否可以通过用 UVB 光照射叶子和切片水果 1 小时来转化为维生素 D 3。叶子的处理非常有效，导致维生素 D 3的产量接近 200 μg g -1干重（图2e）。果实产量较低，绿色果实达到 0.3 μg g -1干重，红色果实达到0.2 μg g -1干重，反映出与叶子相比，绿色果实和红熟果实中 7-DHC 含量下降（图.2e ). 一个中等大小的番茄干重约为 8-10 克，而一个Sl7-DR2突变番茄中维生素 D 3的含量接近推荐的绿色水果 30% 和红色水果 20%每日允许量 (RDA) 根据每天 2.8 微克（英国）和每天 4.3 微克（美国）的基线膳食摄入量计算21 , 22。成熟水果中的维生素 D 3可能会因长时间暴露于 UVB 而进一步增加。 胆固醇/SGA 生物合成的重复途径存在于茄科的其他粮食作物中，包括茄子 ( Solanum melongena )、马铃薯 ( Solanum tuberosum ) 和辣椒 ( Capsicum annuum ) 。番茄叶片和绿色果实中胆固醇/SGA 生物合成、7-DHC 积累和光合作用之间的密切关联（图1c、d和2b–d）表明胡椒中 7-DR2 活性的敲除，水果在食用时可能是绿色的，也可能提供维生素 D 3生物强化的植物性食物。增加 UVB 渗透到新鲜水果中的突变，例如y在番茄中，会导致“粉红番茄”表皮中防紫外线查耳酮的损失，可能会增加 UVB 将维生素 D 3原转化为维生素 D 3的能力。这种堆叠可以通过进一步的基因编辑或基因渗入来实现。Sl7-DR2突变体的叶子是维生素 D 3原的丰富来源，因此可以提供一种重要的新原料，使用番茄种植产生的废弃植物材料从适合素食者的植物中制造维生素 D 3补充剂。编辑Sl7-DR2可以在任何优质番茄品种中产生类似的变化，这意味着可以将番茄开发为基于植物的、可持续的维生素 D 3来源。  05 原文获取 原文链接： https://www./articles/s41477-022-01154-6 PDF获取： https://www./h-nd-158.html |
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