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研究背景： 骨肉瘤主要发生在长骨干骺端，是儿童和青少年癌症死亡的第二大主要因素。为了帮助改善骨肉瘤的治疗，确定新的治疗靶点和生物标志物是至关重要的。与正常细胞不同，癌细胞经常经历代谢重编程。代谢重编程是指肿瘤细胞在饥饿状态下代谢模式的改变，以适应营养微环境;即通过充足的营养摄入来适应自身快速生长的要求，代谢重编程是恶性肿瘤的一个重要标志。近年来，脂质合成的重编程被认为是肿瘤生长所需的另一个重要代谢异常，其中胆固醇生物合成途径的改变至关重要。当前所知，目前还没有与糖酵解和胆固醇合成相关的基因标记可以预测骨肉瘤患者的预后。 本文从投稿到接收不到一个月
肿瘤分型文章比较重要的结论就是分型后构建的评分能够预测免疫治疗或者其他治疗的疗效。可以用于分型的基因集很多，比如焦亡，坏死性凋亡，铁死亡，自噬，铜死亡，m7G，细胞衰老，各类代谢等等。小编还有一些比较前沿的热点，也是小编出去开会时了解到的，暂时不会公开宣传。 如果想做类似的分析，可以添加微信联系小编咨询。 请扫描下方二维码 研究结果： 一、通过糖酵解和胆固醇合成相关基因（GCSRGs）表达分析骨肉瘤患者的4种亚型 1、去除批量效应后，将GSE21257数据集和TARGET-OS数据集中的RNA-seq数据和临床信息进行集成。 2、以基因为主体进行一致聚类，去除共表达的混合代谢基因C2和C3，分别得到共表达的代谢基因，包括共表达的糖酵解基因C1和共表达的胆固醇基因C4(图1A)。 3、根据GCSRGs的中位表达水平将整个队列分为4种代谢亚型。糖酵解和胆固醇合成为静止型，糖酵解和胆固醇合成0为糖酵解亚型，糖酵解和胆固醇合成为胆固醇亚型，糖酵解和胆固醇合成为混合子型(图1B)。 4、图1C中为4个亚型中GCSRGs的表达水平。 5、从4个子型的主成分分析来看，4个子型的主成分具有较好的判别度(图1D)。 6、进一步分析亚型间预后差异，发现不同亚型间预后差异显著。其中糖酵解亚型的预后明显好于胆固醇亚型，静止亚型的预后明显好于混合亚型，混合亚型的预后与胆固醇亚型相似(图1E)。 7、为了进一步分析不同亚型之间肿瘤微环境的差异，ESTIMATE算法将免疫、基质和ESTIMATE评分按静态亚型进行排序;糖酵解亚型胆固醇亚型混合亚型，但肿瘤纯度呈相反趋势(图1F-I)。
二、GCSRGs共表达网络与生物活性 1、WGCNA用于发现更多的gcsrg进行进一步研究。当软阈值为4时，基因网络具有较高的内部连通性和基因相似性(图2A)。 2、使用混合动态剪切树，在每个基因网络模块至少25个基因的情况下，发现16个网络彼此不同，并用不同的颜色表示它们(图2B)。 3、然后筛选出与糖酵解和胆固醇合成相关性较强的模块，即暗蓝模块和黄色模块(图2C)。 4、图2D, E显示了两个模块的基因显著性和模块隶属度。在这些变量值之间确定了稳健的正相关关系。 5、采用ClusterProfiler R包进行GO和KEGG通路富集分析。气泡图显示了GO-BP、GO-CC、GO-MF的前10位和KEGG的前7位。GO功能标注显示，GCSRGs主要与缺氧反应、氧反应降低、局部粘附、细胞底物连接、核糖体、核糖体结构成分、单糖结合有关(图3A)。 6、KEGG功能注释显示，GCSRGs在癌症中主要与核糖体、HIF-1信号通路、糖酵解/糖异生、中枢碳代谢等通路相关(图3B)。
三、预测骨肉瘤患者OS的GCSRGs特征的鉴定和构建整个队列随机分为训练队列和验证队列。 1、对训练队列中的关键代谢基因(午夜蓝和黄色模块中的基因)进行单因素Cox分析，通过生存R包筛选预后相关基因，12个基因与患者预后相关(图4A)。 2、如图4B-G所示，列出了P值由低到高的前6个基因的Kaplan-Meier (KM)生存曲线。 3、基于LASSO的Cox回归，在交叉验证中，有12个基因达到部分似然估计偏差的最小值(图4H, I)。 4、训练、验证和总队列均根据中位数风险评分分为高风险组和低风险组。在三个队列中，我们发现低风险组的生存概率明显大于其他组(图5A-C)。 5、ROC曲线分析评估GCSRGs特征是否是骨肉瘤患者的有效预后预测指标。训练队列基因特征预测的1、3、5年AUC分别为0.873、0.889、0.856;在验证队列中，分别为0.673、0.810、0.823;在总队列中，分别为0.747、0.835、0.820(图5D-F)。 6、在低危组中，4个高危基因(RPS28、MCAM、TRAM2、VEGFA)表达较低，而低危基因EN1表达较高(图5G-I)。 7、比较了3个队列中两组患者的生存状况(图5J-L)，并绘制了危险基因表达热图(图5M-O)。
四、GCSRGs特征的独立预后分析 1、为了确定风险评分和其他临床特征是否是骨肉瘤患者的独立预后因素，进行了单因素和多因素Cox回归分析。 2、单因素Cox回归分析显示，骨肉瘤患者的风险评分(P = 0.019)和转移的临床病理参数(P = 0.001)是独立的预后因素（图6A）与多元Cox回归分析结果相同(图6B)。 3、用于估计骨肉瘤患者生存可能性的预后诺模图(图6C)。 4、预后图可以系统地预测骨肉瘤患者的1年、3年和5年的OS。校准曲线显示，实际结果与预测结果一致(图6D)。
五、GCSRGs特征的免疫图谱和药敏分析 1、为了确认GCSRGs特征是否与肿瘤免疫相关，使用ssGSEA方法评估两组间免疫细胞浸润的差异。如图7A所示，嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞在两组间有显著性差异。。 2、如图7B所示，两组间LGALS9、HAVCR2、LAIR1、TNFSF4、PDCD1LG2、TNFSF15、ICOS、CD200R1、TNFSF14、BTLA等免疫检查点的表达存在显著差异，低风险组的表达高于低风险组，提示免疫治疗的疗效可能存在有限差异。 3、药敏分析显示高危组患者对11种药物敏感(图7C)。
六、TRAM2体外功能验证 1、通过Western blot结果显示，TRAM2在骨肉瘤细胞系中的表达高于人成骨细胞系(图8A)。 2、Western blot结果证实了转染效率(图8B)，选择si-TRAM2-2进行进一步实验。 3、根据CCK8实验结果，TRAM2下调抑制了HOS和U2OS细胞系的活力(图8C)。 4、平板克隆实验结果显示，下调TRAM2表达抑制了HOS和U2OS细胞系的集落形成能力(图8D)。 5、进行了细胞划伤和Transwell细胞侵袭试验。实验结果表明，TRAM2下调抑制了HOS和U2OS细胞的迁移能力(图8E)和侵袭能力(图8F)。 6、检测了TRAM2下调对EMT相关蛋白表达的影响。Western blot结果显示，TRAM2下调促进了HOS和U2OS细胞系中E-cadherin的表达，同时抑制了N-cadherin和vimentin的表达(图8G)。
七、TRAM2的泛癌分析 1、为了进一步分析TRAM2在其他恶性肿瘤中的重要作用，对TRAM2进行了泛癌分析。图9A显示了TRAM2在33种癌症中的表达，其中TRAM2在SARC中表达最高。 2、在几种类型的癌症中，TRAM2在肿瘤组织和正常癌旁组织中的表达有显著差异(图9B)。 3、如图9C-E所示，TRAM2与一系列癌症的OS、无进展生存期(PFS)和疾病特异性生存期(DSS)相关。 4、TRAM2在一系列癌症中与TMB和MSI相关(图9F, G)。 5、为了阐明TRAM2与免疫相关基因和免疫检查点的关系，我们进行了基因共表达分析。如图9H, I所示，TRAM2可以影响泛癌中的免疫细胞浸润和免疫检查点表达。
总结：在本研究中，根据GCSRGs表达基质将骨肉瘤患者分为4个亚型，这些亚型在预后和肿瘤微环境方面存在显著差异。通过WGCNA筛选与糖酵解和胆固醇合成关系最密切的基因模块，首次构建了由5个GCSRGs组成的骨肉瘤风险特征。此外，发现该特征与骨肉瘤患者的免疫细胞浸润和免疫检查点表达密切相关。这些发现不仅为预测骨肉瘤患者的预后提供了新的方法，而且提供了新的治疗靶点。 |
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