大家好,这里是专注表观组学十余年,领跑多组学科研服务的易基因。 此前,我们分享了m6A RNA甲基化研究的数据挖掘思路(点击查看详情),进而筛选出m6A修饰目标基因。 做完MeRIP-seq测序后,如果需要对分析结果中感兴趣的内容进行后期验证,则需要进行下游实验设计。m6A RNA甲基化修饰目标基因的进一步验证或后期试验包括以下6个方面: 简单验证 全局m6A甲基化干扰实验(非靶向),验证m6A甲基化书否真的影响目标基因表达和细胞功能 靶向目标基因的甲基化/去甲基化实验,检测某区域m6A修饰是否真的影响目标基因的表达 研究目标基因的m6A甲基化如何影响目标基因表达 m6A修饰目标基因的表达回复实验 研究特定m6A Readers通过结合目标基因RNA而影响目标基因的蛋白表达
(1)简单验证 目标基因m6A甲基化的验证:MeRIP-RT-PCR 检测目标基因的mRNA表达水平:RT-qPCR 检测目标基因蛋白质表达水平:Western blot
(2)全局m6A甲基化干扰实验(非靶向),验证m6A甲基化书否真的影响目标基因表达和细胞功能 m6A甲基化干扰:m6A writers/erasers的突变/敲降/敲除/过表达、m6A甲基化抑制剂 如环亮氨酸、m6A去甲基化抑制剂如FTO抑制剂FB23-2 检测m6A甲基化整体变化:m6A甲基化免疫荧光染色(定性)、m6A斑点杂交(定性)、比色法(定量)、质谱法(定量) 检测目标基因的m6A甲基化变化:MeRIP-qPCR 检测目标基因的mRNA水平:RT-qPCR 检测目标基因蛋白质水平:Western blot 检测细胞功能/表型变化 FB23-2给药后,大脑损伤组神经功能缺陷评分显著变差
(3)靶向目标基因的甲基化/去甲基化实验,检测某区域m6A修饰是否真的影响目标基因的表达 目的基因m6A甲基化干扰细胞系的构建:荧光素酶活性分析实验(Luciferase activity assay)——构建含甲基化/未甲基化m6A位点的目标基因-荧光素酶表达质粒,转染细胞并表达。 检测目标基因的m6A甲基化变化:MeRIP-qPCR 检测荧光素酶报告基因的mRNA表达水平:RT-qPCR 检测目标基因蛋白质表达水平:Western blot 检测细胞功能受到的影响:免疫荧光显微观察、功能标志物测定... ... 用于验证目标基因上m6A甲基化功能的双荧光素酶报告系统
(4)研究目标基因的m6A甲基化如何影响目标基因表达 检测m6A是否通过影响目标基因翻译而影响蛋白质水平: Polysome profiling Ribo-seq 通过对结合核糖体上的mRNA进行定量,分析目标基因的蛋白翻译效率 通过对结合核糖体上的mRNA进行定量,分析目标基因的蛋白翻译效率Polysome Profiling方法举例: siMETTL3/14对目标基因与与核糖体的结合造成影响,对内参基因GAPDH无影响。研究m6A是否通过调节mRNA的稳定性和降解而影响目标基因蛋白水平 研究m6A对目标基因mRNA水平的影响 RT-qPCR RNA-seq METTL3/14干扰后,采用RT-PCR和RNA-seq检测目标基因的mRNA水平是否收到影响研究m6A是否通过调控RNA的出核(nuclear export)而影响目标基因蛋白水平
裂解细胞,超速离心分离细胞核与细胞质,然后分别进行RT-PCR实验检测细胞核与细胞质中的mRNA水平 METTL3/14干扰后,采用RT-PCR检测目标基因在细胞核与细胞质中的mRNA水平是否受到影响
(5)m6A修饰目标基因的表达回复实验 writers的突变/敲降/敲除实验: RT-PCR检测目标基因的mRNA水平变化 Western blot检测目标基因的蛋白水平变化 检测目标基因的功能 writers的突变/敲降/敲除后,目标基因的过表达回复实验:
检测各项表型指数、细胞增殖、分化的回复情况 METTL3敲除后,靶基因Ezh2的蛋白表达受到影响。而靶基因Ezh2过表达回复实验会消除METTL3敲除对细胞增殖分化的不利影响
(6)研究特定m6A Readers通过结合目标基因RNA而影响目标基因的蛋白表达 合理推测结合目标基因的m6A Readers是哪一种 Readers的突变/敲降/敲除/过表达实验:
RT-PCR验证靶基因的mRNA水平 Western blot验证靶基因的蛋白水平 Readers的RIP-qPCR验证Readers蛋白与靶基因mRNA的结合 YTHDF1引入突变后,检测其假定靶基因的表达和与靶基因的结合是否受到影响
关于易基因RNA m6A甲基化测序(MeRIP-seq)技术 易基因MeRIP-seq技术利用m6A特异性抗体富集发生m6A修饰的RNA片段(包括mRNA、lncRNA等rRNA去除所有RNA),结合高通量测序,可以对RNA上的m6A修饰进行定位与定量,总RNA起始量可降低至10μg,最低仅需1μg总RNA。广泛应用于组织发育、干细胞自我更新和分化、热休克或DNA损伤应答、癌症发生与发展、药物应答等研究领域;可应用于动物、植物、细胞及组织的m6A检测。 大样本量m6A-QTL性状关联分析,传统MeRIP单个样品价格高,通常难以承担。易基因开发建立MeRIP-seq2技术,显著提成IP平行性,实现不同样本间相对定量,降低检测成本。
易基因提供适用于不同科研需求的MeRIP技术: m6A甲基化-常量mRNA 甲基化测序(MeRIP-seq) m6A甲基化-常量mRNA +lncRNA甲基化测序(lnc-MeRIP-seq) m6A甲基化-微量mRNA +lncRNA甲基化测序(Micro-lnc-MeRIP-seq) 高通量m6A甲基化-常量mRNA甲基化测序(MeRIP-seq2)
技术优势: 起始量低:样本起始量可降低至10-20μg,最低仅需1μg总RNA; 转录组范围内:可以同时检测mRNA和lncRNA; 样本要求:可用于动物、植物、细胞及组织的m6A检测; 重复性高:IP富集重复性高,最大化降低抗体富集偏差; 应用范围广:广泛应用于组织发育、干细胞自我更新和分化、热休克或DNA损伤应答、癌症的发生与发展、药物应答等研究领域。
研究方向: m6A甲基化目前主要运用在分子机制的理论性研究 环境暴露与响应:污染、抗逆、生活方式 易基因科技提供全面的RNA甲基化研究整体解决方案,技术详情了解请致电易基因。 相关阅读: 干货系列:m6A RNA甲基化研究的数据挖掘思路 干货分享:DNA甲基化研究的测序数据挖掘思路 独家分享:高通量测序后的下游实验验证方法——DNA甲基化篇 项目文章 | 90天见刊,易基因m6A RNA甲基化(MeRIP)+转录组组学研究
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