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侧孢芽孢杆菌在灭除蝇蛆中的应用及其培养方法

技术领域

本发明属于微生物除蚊蝇技术领域，具体涉及侧孢芽孢杆菌在灭除蝇蛆的应用，还涉及上述的侧孢芽孢杆菌的培养方法。

背景技术

畜禽养殖或畜牧养殖过程中，极容易滋生蚊蝇，目前常见的蚊种类已超过300多种；常见的蝇有小家蝇、绿蝇、大头金蝇和丽蝇。在高温高湿的夏季，由于苍蝇和蚊子大量滋生，加速了动物疫病的传播，已经成为当前疫病暴发的安全隐患，给养殖业带来了诸多不良影响，同时蚊蝇还传播人类的多种疾病，是人兽共患病的主要传播媒介之一，其危害主要体现在以下几个方面：1.妨碍禽畜休息，降低禽畜产量；2.携带病菌，传播疾病；3.威胁人员健康，降低工作效率。

关于畜禽养殖或者是畜牧养殖，目前主要采取的措施是，环境控制、饲料配比、化学方法，比如结合石灰水和农药清洗，比如用化学药剂灭杀；化学杀虫剂广泛运用于灭蚊导致了严重的环境污染问题，并且在畜牧养殖中采用化学杀虫剂也会影响养殖的安全性。除此之外，还采用生物方法，比如栽花种草，培养天敌比如蜘蛛、壁虎、蛙类等；但是上述的生物方法效果有限。关于生物灭蚊剂，苏晓庆发表过文章《一种新型的生物灭蚊剂贵阳腐霉制剂》，该文章中披露：现在主打的微生物灭蚊剂是苏云金杆菌以色列变种和球形芽孢杆菌，这两种灭蚊菌有很多优点，例如灭蚊效果好，易于生产、储存和施用，但是也有缺点，比如Bti持效期短，Bs易于诱导蚊虫产生抗药性等，为了大力推广蚊虫生物防治，迫切需要开发新的生物灭蚊剂。

现有发明主要存在问题及不足之处：

1.现有发明没有针对养殖业粪便产生的蝇蛆；

2.大多以喷雾的形式使用，只能驱除空气和接触面的蚊蝇，不能解决粪便中的蝇蛆幼虫；

因此，需要针对于上述的方案的不足，发明一种安全有效的能应用于畜禽养殖或者是畜牧养殖中的生物灭蚊剂，尤其是微生物灭蚊剂。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种微生物灭蚊剂，即侧孢芽孢杆菌，可直接作为灭蝇剂，解决畜禽养殖厂蝇蛆问题；并且还提供了上述的侧孢芽孢杆菌的培养方法。

侧孢芽孢杆菌菌剂在灭除蝇蛆中的应用；以及侧孢芽孢杆菌菌剂在灭除畜牧养殖场或畜禽养殖厂内的蝇蛆中的应用；侧孢芽孢杆菌菌剂在制备用于灭除畜牧养殖场或畜禽养殖厂内的蚊蝇的灭蚊剂、灭蚊药、灭蚊水中的应用，都是本发明所要保护的范围。

以上的应用，可以将侧孢芽孢杆菌菌剂添加于畜禽粪便中，使孢子浓度为6×108cfu/g粪便。

上述的粪便为鸡粪、猪粪、牛粪、羊粪中的任一种，当然不限于以上的种类。

侧孢芽孢杆菌菌剂在制备具有灭除蝇蛆作用的饲料中的应用，也是本发明所要保护的范围。

上述的将本发明的菌剂应用于饲料制备中，是将侧孢芽孢杆菌加入到饲料中，使孢子浓度为1～9×1010cfu/g饲料。

上述的侧孢芽孢杆菌的16sRNA序列如序列1所示。

上述的侧孢芽孢杆菌菌剂的培养方法如下：

(1)选取侧孢短芽孢杆菌斜面母种进行摇瓶种子培养：一个斜面接种8个装液量为400mL的1000mL摇瓶；培养温度32～39℃；转速180～220r/min；培养时间18～24h；所用培养基配方为：氯化钠1％，蛋白胨1％，酵母膏0.5％，pH7.0；

(2)种子罐培养：接种量5～10％；温度35～39℃；搅拌速度150～400r/min；通气量3～4m3/min；罐压0.05Mpa；培养时间20～26h；所用配方为：玉米粉60～70g/L，鱼蛋白胨10～15g/L，氯化钠4-6g/L，硫酸镁0.1～0.25g/L，KH2PO42～4g/L；

(3)发酵培养：接种量5～10％；温度35～39℃；搅拌速度150～400r/min；通气量3～4m3/min；罐压0.05Mpa；培养时间40～48h；所用配方为：玉米粉60～70g/L，鱼蛋白胨10～15g/L，氯化钠4～6g/L，硫酸镁0.1～0.25g/L，KH2PO42～4g/L；

(4)将步骤(3)得到的发酵液用喷塔按常规方法进行喷雾干燥，获得粉末状的侧孢芽孢杆菌菌剂。

本发明所提供的侧孢芽孢杆菌的16sRNA序列如序列1所示。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明提供的侧孢芽孢杆菌菌剂用于畜禽养殖或畜牧养殖中，其安全性高，实用性强，为微生物菌剂应用于蚊蝇灭除中提供了一个崭新的方法和思路；

(2)本发明所提供的侧孢芽孢杆菌菌剂，可直接应用于畜禽养殖粪便中蝇蛆的杀灭中，使蝇蛆成虫死亡率达到77.2％，幼虫死亡率高达87.9％；

(3)本发明的侧孢芽孢杆菌菌剂还可以应用于饲料中，使蚊蝇成虫及幼虫死亡率分别为95.8％、100％。

具体实施方式

为了能使本领域技术人员更好的理解本发明，现结合具体实施方式对本发明进行更进一步的阐述。

实施例1

侧孢芽孢杆菌菌剂的培养方法如下：

(1)选取侧孢短芽孢杆菌斜面母种进行摇瓶种子培养：一个斜面接种8个装液量为400mL的1000mL摇瓶；培养温度35℃；转速200r/min；培养时间20h；所用培养基配方为：氯化钠1％，蛋白胨1％，酵母膏0.5％，pH7.0；

(2)种子罐培养：接种量8％；温度37℃；搅拌速度240r/min；通气量3.5m3/min；罐压0.05Mpa；培养时间24h；所用配方为：玉米粉60g/L，鱼蛋白胨10g/L，氯化钠4g/L，硫酸镁0.1g/L，KH2PO42g/L；

(3)发酵培养：接种量8％；温度37℃；搅拌速度300r/min；通气量4m3/min；罐压0.05Mpa；培养时间44h；所用配方为：玉米粉60g/L，鱼蛋白胨10g/L，氯化钠4g/L，硫酸镁0.1g/L，KH2PO42g/L；

(4)将步骤(3)得到的发酵液用喷塔按常规方法进行喷雾干燥，获得粉末状的侧孢芽孢杆菌菌剂。

实施例2

侧孢芽孢杆菌菌剂的培养方法如下：

(1)选取侧孢短芽孢杆菌斜面母种进行摇瓶种子培养：一个斜面接种8个装液量为400mL的1000mL摇瓶；培养温度38℃；转速210r/min；培养时间24h；所用培养基配方为：氯化钠1％，蛋白胨1％，酵母膏0.5％，pH7.0；

(2)种子罐培养：接种量8％；温度38℃；搅拌速度200r/min；通气量4m3/min；罐压0.05Mpa；培养时间20h；所用配方为：玉米粉65g/L，鱼蛋白胨13g/L，氯化钠5g/L，硫酸镁0.15g/L，KH2PO43g/L；

(3)发酵培养：接种量8％；温度38℃；搅拌速度180r/min；通气量4m3/min；罐压0.05Mpa；培养时间45h；所用配方为：玉米粉65g/L，鱼蛋白胨13g/L，氯化钠5g/L，硫酸镁0.15g/L，KH2PO43g/L；

(4)将步骤(3)得到的发酵液用喷塔按常规方法进行喷雾干燥，获得粉末状的侧孢芽孢杆菌菌剂。

实施例3

侧孢芽孢杆菌菌剂的培养方法如下：

(1)选取侧孢短芽孢杆菌斜面母种进行摇瓶种子培养：一个斜面接种8个装液量为400mL的1000mL摇瓶；培养温度36℃；转速200r/min；培养时间22h；所用培养基配方为：氯化钠1％，蛋白胨1％，酵母膏0.5％，pH7.0；

(2)种子罐培养：接种9％；温度35℃；搅拌速度400r/min；通气量3m3/min；罐压0.05Mpa；培养时间22h；所用配方为：玉米粉70g/L，鱼蛋白胨15g/L，氯化钠6g/L，硫酸镁0.25g/L，KH2PO44g/L；

(3)发酵培养：接种量5％；温度35℃；搅拌速度150r/min；通气量3m3/min；罐压0.05Mpa；培养时间40h；所用配方为：玉米粉70g/L，鱼蛋白胨15g/L，氯化钠6g/L，硫酸镁0.25g/L，KH2PO44g/L；

(4)将步骤(3)得到的发酵液用喷塔按常规方法进行喷雾干燥，获得粉末状的侧孢芽孢杆菌菌剂。

实施例4

4.1侧孢短芽孢杆菌菌剂应用于畜禽粪便中蚊蝇灭除，具体的步骤如下：将实施例1～3中的侧孢短芽孢杆菌剂与新鲜的粪便直接混合，1天后开始分析检测粪便中蝇蛆数量，对照例为直接检测未加入侧孢短芽孢杆菌菌剂粪便。

表1不同浓度的侧孢短芽孢杆菌菌剂灭蝇蛆后成虫死亡率(％)

添加浓度(亿cfu/g粪便) 0 1×10⁸ 2×10⁸ 3×10⁸ 4×10⁸ 5×10⁸ 6×10⁸ 实施例1 0.64 45.3 54.1 63.5 74.3 88.5 98.7 实施例2 0.72 44.8 54.4 63.1 74.2 87.9 98.4 实施例3 0.69 45.6 53.9 63.8 73.8 88.8 98.9

表2不同浓度的侧孢短芽孢杆菌菌剂灭蝇蛆后幼虫死亡率(％)

从上表1、2中可以看出，当侧孢短芽孢杆菌菌剂的浓度达到6×108时，其对于蝇蛆成虫的灭杀效果较好，达到了98.4％以上；当其浓度达到4×108时，其对于幼虫的灭杀效果较好，三个实施例中灭杀的效果都达到了100％。

4.2侧孢短芽孢杆菌菌剂应用于饲料中，对于蝇蛆灭杀的死亡率如下：

将不同量的固体产品侧孢短芽孢杆菌菌剂与饲料混合，饲喂817肉鸡，隔天开始检测粪便中蝇蛆数量，对照例为饲料组未加入侧孢短芽孢杆菌菌剂的应用例；使每克饲料中孢子浓度分别为0，1×107，1×108，1×109，1×1010cfu/g；

表3不同浓度的侧孢短芽孢杆菌菌剂应用于饲料后灭蝇蛆后成虫死亡率(％)

表4不同浓度的侧孢短芽孢杆菌菌剂应用于饲料后灭蝇蛆后幼虫死亡率(％)

从上表3、4中可以看出，侧孢短芽孢杆菌菌剂的浓度达到1×1010时，其对于成虫的灭杀率能达到77％左右；对幼虫的灭杀率能达到87.3％左右；总体上呈现出较好的应用效果，但是与4.1直接将其投入到粪便中相比，对于蚊蝇的灭杀效果略差。

4.3关于市售灭蚊蝇产品与本发明侧孢短芽孢杆菌应用于粪便中，1天后，检测其对于蚊蝇成虫和幼虫的灭杀率，结果如下：

表5不同用量的侧孢短芽孢杆菌菌剂直接应用于粪便成虫死亡率(％)

从以上表5中可以看出，市售产品灭蚊蝇效果明显不如本发明产品，试验组1结果表明，加入侧孢短芽孢杆菌菌剂之后对于成虫或幼虫的死亡率达到了95.％和100％；而加入市售产品之后，其成虫和幼虫的死亡率仅为60.3％、12.8％。

实施例5

本发明的侧孢短芽孢杆菌菌剂在制备灭蚊剂中的应用，包括以下的步骤：取本发明的侧孢短芽孢杆菌菌剂适量，溶于5L水中，在25r/min的转速下搅拌均匀，获得灭蚊剂。

将上述的灭蚊剂加入到粪便中，参照实施例4中4.1的用量加入，经检测，杀灭了畜禽粪便中90％以上的蝇蛆幼虫；85％以上的成虫。

实施例6

本发明的侧孢短芽孢杆菌菌剂在制备饲料中的应用，具体的步骤如下：

取本发明的侧孢短芽孢杆菌菌剂适量，与饲料进行混匀，使每克饲料中孢子浓度为1×1010cfu/g，再饲喂畜禽，与对照例相比，检测猪粪中的蝇蛆，发现成虫的死亡率达到了77.1％左右，幼虫的死亡率达到了82.4％左右。

序列表

<110> 山东天润和生物工程有限公司

<120> 侧孢芽孢杆菌在灭除蝇蛆中的应用及其培养方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1151

<212> RNA

<213> 侧孢芽孢杆菌(Latin Name Bacillus laterosporus Laubach)

<400> 1

cagaggcggc acagcaacga gcggaccgag ggagcgcccc aagagcggcg gacggggaga 60

acacggagaa ccgccgaaga cgggaaacac gggaacacgg gcaaaccaga ggggaaccgc 120

aggcagacaa aaaggggccg gcaccacaca gaggacccgc ggcgcaagca ggggaggaac 180

ggccaccaag gcaacgagcg aagccgaccc agaggggaac ggccacacgg gacgacacac 240

ggcacagacc cacgggaggc agcagaggga acccgcaagg acgaaagcga cggagcaacg 300

ccgcggagga gaaggacgaa cgaaagccgg agggaagaac aaggccgcaa aagggcggca 360

ccgacggacc aaccagaaag ccacggcaac acgaccagca gccgcagaaa cgaggggcaa 420

gcggccggaa agggcgaaag gccgcaggcg gcaagcgagg aaagccaccg gccaaccggg 480

gagggcagga aacggggaac gaggaagaag aggagaggga accacggagc gggaaagcga 540

gagagggaga acaccagggc gaaggcgacc cggcgaacga cgcgaggagc gaaagcggga 600

ggcgaacagg aagaacccgg agccacgccg aaacgagagg caaggagggg gccgcaccag 660

gcgcagcaac gcaaagcacc cgccggggag acgcgcaaga cgaaaccaaa ggaagacgga 720

gcacgccaag cggggagcag ggaacgaagc aacgcgaaga accaccaggc gacacccgac 780

accagagaag gacgcccccg gcggcagagg acagggggca gggcgcagcc ggcggagagg 840

ggaagcccgc aacgagcgca acccgacagg ccagcacagg ggcaccaagg gacgccggga 900

caaaccggag gaagggggga gacgcaaaca cagccccaga ccgggcacac acggcacaag 960

gacagaacaa agagcagcga accgcgagga agccaaccca caaacgccag cggacgcagc 1020

gcaaccgacg cggaagcgga acgcagaacg cggacagcag ccgcgggaaa cgcccgggcc 1080

gacacaccgc cgcacaccac gagaggacac ccgaagcgag aggaaccagg agccagccgc 1140

agaagacgcc a 1151