  翻译：张春莹-四川大学华西医院   08 形态学评价  8.1 涂片准备 8.1.1 细胞离心 由于涂抹制片无法保存细胞的完整形态，因此不推荐对液体标本进行涂抹制片。用于自然干燥的体液涂片，推荐使用细胞离心机制片，因为这种方法可以浓缩细胞、减少细胞变形且可获得单细胞层。脑脊液或其他体液标本采用细胞离心机制得的涂片，用Romanowsky类染色后显示出较好的形态学特征，体液细胞与血液、骨髓中相应的细胞形态类似。细胞通常随机分散在一个小的圆形区域内，可通过微小的差异对有核细胞进行亚型分类。当怀疑肿瘤细胞时，由于肿瘤细胞的量可能较少，因此需要对涂片的所有细胞区域进行显微镜检查。 细胞离心机设备通常包含一个离心盘和多个涂片配件单元，配件包括一片放在玻片上的滤纸和一个盛放标本的样本孔，夹子将两者固定在一起。样本孔正对着滤纸上的孔，在玻片上露出一个圆形区域。静止时，样本孔中的液体样本不会接触到玻片。离心过程中，液体和细胞被推到载玻片上。滤纸将液体吸收，而细胞沉淀在玻片上。 通过细胞离心技术，细胞可被浓缩20倍。即使是计数板计数为0的细胞数量很少的样本，每张载玻片上也可获得将近35个细胞。但细胞回收率从30%-75%不等，体积较小的细胞，如淋巴细胞，回收率可能被低估。离心的速度和时间、样本孔中的样本量，以及滤纸的吸收能力均可影响细胞回收率和细胞形态。 虽然细胞涂片离心机不是复杂的仪器，但一些样本的处理和操作技术可能有助于提高涂片的质量。 玻片应新鲜无污染。细胞离体后可能在几小时内开始退化，特别是蛋白含量低的体液样本，如脑脊液。如果在使用细胞离心机制片前有较长时间的延迟(如脑脊液超过4小时)，报告中应包括一项声明，说明由于细胞变性，分类计数结果可能不准确。 胸腔积液、心包液、腹腔积液和关节腔积液样本可能含有纤维蛋白和其他蛋白而堵塞滤纸片，导致细胞收集率降低并影响细胞在载玻片上的分布。在离心制片前需对细胞进行清洗，将样本离心并用生理盐水重悬，可以提高细胞收集率和保持细胞形态。 如果有凝块，细胞计数和分类计数可能都不准确。但制得的玻片不影响检查恶性细胞。在将部分样本洗涤和离心之前，应轻轻搅动凝块以释放包裹的细胞。 将400单位的透明质酸酶(溶液或粉状)加入约1毫升的液体中，37°C孵育10分钟，即可液化粘性关节腔积液。液化后清洗细胞对提高涂片质量也有帮助。 细胞较多的标本或血性标本在细胞离心前需用生理盐水稀释，以避免细胞在玻片上过于拥挤，否则易导致细胞聚集及形态扭曲而使细胞难以鉴别。根据细胞计数结果使用标准的样品稀释方案，每个样品即可获得具有均匀、单层细胞的涂片。恰当的稀释取决于计数池中样本的细胞数量以及细胞离心机的速度和时间。另外，对于血性标本，一些实验室倾向于在细胞离心前先轻轻溶解红细胞。 在加入样本前，先在样本管中加一滴22%的无菌白蛋白，可以增强细胞对载玻片的粘附性，减少细胞破坏，特别是对于脑脊液等低蛋白样品。 样本管出口与滤纸孔正确对齐，对于优化细胞回收率至关重要。 细胞离心后残留在样本管内的液体不能再回流到载玻片上。用于Romanowsky类染色的自然干燥的细胞离心涂片在固定和染色前必须保持无水分。如果未固定的涂片变湿，会导致细胞出现“皱缩”或“聚集”现象。 8.1.2其他 用于细胞形态学评估的其他方法包括沉淀法以及离心后重悬沉渣推片法。这些方法难以标准化，制得的涂片质量参差不齐。这些方法不如细胞离心法，因此不推荐使用。在细胞病理学实验室中广泛使用的过滤方法在血液学实验室中不太实用，因为这涉及乙醇预固定，涂片就不能再用于自然干燥涂片的Romanowsky类染色。 8.2形态学成分的鉴别 以下描述适用于使用细胞离心机制得合格涂片，使用Romanowsky染色。强调了与典型血液或骨髓形态有差异的部分。由于细胞离心法获得的是单细胞层，因此这些细胞可能比血液或骨髓涂片中的稍大。也可能出现胞浆嗜碱性增强、胞质颗粒着色偏蓝。 8.2.1 红细胞系 中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞：所有成熟阶段的细胞与血液或骨髓中的成熟阶段细胞相似。中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的分叶更明显，分叶核常位于细胞膜周围。当血液中的中性粒细胞出现中毒颗粒或空泡时，体液中的中性粒细胞中也会出现。但是，小空泡可出现在许多体液细胞中，可能是由于退行性变化或细胞离心所致。中性粒细胞和嗜酸性粒细胞可吞噬体液中的微生物。 中性粒细胞退化：体液中的中性粒细胞常见退化现象，尤其是中性粒细胞增多时。退化的中性粒细胞胞核固缩，呈小而致密的圆形块状。如果有中毒颗粒，颗粒可凝集成蓝色团块。这些细胞可类似于有核红细胞，但通常细胞质中的一些残留的偏蓝色颗粒，可帮助检验者将其识别为中性粒细胞。 8.2.3 淋巴细胞系 淋巴细胞：典型的小淋巴细胞比血涂片中的略大，通常细胞质更丰富。可见小核仁。胞质中有时可见少量的蓝色颗粒。 反应性淋巴细胞：反应性淋巴细胞常见于体液中，形态变化多样。胞核一般呈圆形或轻度凹陷 (豆形)，胞质丰富，着色从淡蓝色至深嗜碱性。T或NK反应性淋巴细胞常含有少量蓝色颗粒，而B淋巴细胞偶见多个小的胞质内空泡。免疫母细胞的染色质较少，有多个小核仁，胞质量少呈深嗜碱性，胞质内有时可见少量蓝色颗粒。浆细胞样反应性淋巴细胞的核染色质增厚，有多个小核仁，胞质量多呈深嗜碱性；胞核旁边常见一清晰的高尔基体区。与恶性淋巴瘤细胞相比，反应性淋巴细胞的核膜清晰、光滑，核形规则。通常情况下，反应性淋巴细胞的形态多样，相比之下，浸润的淋巴瘤细胞的外观更均一化。 浆细胞：这些细胞与骨髓中的浆细胞形态相似，常与其他类型的反应性淋巴细胞同时出现。变异浆细胞，如“Mott”细胞(含有丰富的免疫球蛋白小液泡的浆细胞)也可出现在体液中。 8.2.4 单核吞噬细胞系 单核细胞：体液中的单核细胞形态变化多样，从典型的血液中的单核细胞形态，到激活单核细胞（胞质丰富，含少量小空泡）。也有观点认为应将激活单核细胞称为组织细胞。 巨噬细胞：当单核细胞/组织细胞发挥吞噬作用时（如摄入物质，消化后的产物，或摄入大空泡），称为巨噬细胞。巨噬细胞胞体大，核染色质浓缩，胞核圆形或被挤压至细胞一侧，胞质丰富，常有空泡。有时胞质中的空泡合并可形成“印戒”细胞。巨噬细胞的吞噬活性较强，包括吞噬红细胞(红细胞吞噬体)、吞噬中性粒细胞（中性粒细胞吞噬体，关节腔积液中称“Reiter”细胞），吞噬脂质（脂质吞噬体），吞噬微生物和晶体。巨噬细胞内也可能含有蓝黑色含铁血黄素颗粒（噬铁体），此颗粒来源于巨噬细胞吞噬的红细胞消化后产生的铁。巨噬细胞中罕见血红素晶体（黄褐色，菱形），该晶体是由巨噬细胞摄取的红细胞血红蛋白分解产生的游离铁转化而来。 8.2.5 内衬细胞 蛛网膜细胞：蛛网膜下腔或脑腔内的细胞很少脱落至脑脊液。这些细胞可成片状脱落，胞核呈梭形，胞质中等量，呈灰蓝色，胞质中可见黑色色素颗粒。 间皮细胞：间皮细胞排列在胸膜腔、腹膜腔和心包腔内，具有多种形态特征。任何疾病均可能使其增殖并单独或成片脱落至积液中。但成片脱落的间皮细胞之间通常有“窗口”（间皮孔），此特点与非造血恶性细胞形成的紧密簇不同。未受刺激的间皮细胞小于反应性间皮细胞，胞核偏位，核呈圆形至椭圆形，核染色质致密，无核仁，胞质量中等，着色轻至中度嗜碱性，胞质内无颗粒。与浆细胞相反，高尔基区不可见。在慢性积液中，反应性间皮细胞增殖，体积增大，核染色质稍疏松，核仁小。可见多个核仁，与恶性细胞不同，这些间皮细胞的胞核大小大致相同。间皮细胞的退行性改变包括胞质出现空泡，尤其是在细胞周围。间皮细胞也可能有吞噬性，形态变化为与巨噬细胞形态相似的空泡细胞。因此，有时很难区分间皮细胞和巨噬细胞。 滑膜细胞：滑膜细胞来源于关节腔内的滑膜，形态与间皮细胞相似。 8.2.6 恶性肿瘤细胞 淋巴瘤细胞：大细胞淋巴瘤类似于淋巴母细胞，核染色质不成熟，核仁多，胞质中等量，呈嗜碱性。淋巴瘤的细胞学特征还包括：胞核不规则，核膜不明显，核仁大，可见小空泡覆盖在胞核上，无高尔基区。小细胞淋巴瘤很难与正常淋巴细胞区分，可能需要结合流式细胞术或免疫组化来明确鉴别。 非造血恶性细胞：多种恶性肿瘤可侵犯体腔，包括腺癌、肉瘤和原发性脑肿瘤。非造血恶性细胞的细胞学特征包括：胞体大，核质比高，核形不规则，核仁大，核可有多个，大小和形态多变；细胞成簇分布，浆界不清；印戒细胞成簇分布，内有界限分明的空泡，胞核重塑（一个细胞的胞核挤压入相邻细胞的胞核）。 8.2.7 其他细胞 鳞状上皮细胞：来自皮肤的鳞状上皮细胞可污染体液。该类细胞核质比低，核小而圆，染色质致密，胞质丰富，胞体呈棱角状。 内皮细胞：排列在组织血管上的内皮细胞在体液中少见，但脑手术后可偶尔出现于脑脊液中。该类细胞呈条索状，胞核呈纺锤形或椭圆形，染色质呈网状，核仁一个或多个。胞质中可含有少量蓝色颗粒。 软骨细胞：软骨细胞可能偶尔在腰椎穿刺或关节腔穿刺时出现。胞核圆形至椭圆形，染色质浓缩，胞质呈独特的紫红色。 神经组织/神经元：脑脊液中偶见神经组织(细胞碎片和间质，有时伴毛细血管)以及孤立的神经元。组织碎片表现为粉红色或蓝色的纤维基质，有时含退化的胞核物质。完整的神经元或神经节细胞呈锥形，通常有延伸的突起。 生发基质细胞：早产新生儿脑室的室管膜细胞下可见生发基质细胞;它们是原始多能干细胞，形态上类似于原始细胞，可产生神经元细胞。该类细胞通常在组织样基质中形成松散的簇状。 8.2.8病原微生物 细菌：体液中可见杆菌、球菌、分枝丝状菌、抗酸杆菌等，细胞外和细胞内均可见。多数细菌在Romanowsky染色下呈嗜碱性。检验人员可通过其相对均匀的大小和形状，将其与染色沉淀物区分开来。 酵母菌、真菌：多数酵母菌和真菌的外形规则，圆形至椭圆形，深嗜碱性。细胞外和细胞内均可见。在CSF中，隐球菌是一种大的，圆形到椭圆形的酵母样真菌，胞壁较厚。细胞离心可将荚膜破坏，导致“太阳爆裂”外观。 寄生虫:弓形虫、阿米巴和其他较大的寄生虫具有典型的外观特征，但很少出现于体液中。 注:以下图片是体液中常见的细胞类型举例。本指南中图片不能作为形态学图谱。具体图片见指南P20-25。 8.3 有核细胞分类的评价 形态学评估主要包括有核细胞组成的定量或半定量评估。分类计数通常包括: 造血细胞:分叶核/杆状核中性粒细胞、未成熟粒细胞(晚幼粒细胞、中幼粒细胞、早幼粒细胞)、淋巴细胞、反应性淋巴细胞、单核/巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、浆细胞、有核红细胞; 内衬细胞:脑室内衬细胞(CSF)、蛛网膜细胞(CSF)、生发基质细胞(CSF)、间皮细胞(胸水、腹水、心包液)、滑膜细胞; 原始细胞、淋巴瘤细胞、非造血肿瘤细胞; 非典型细胞(注释中有描述)。 报告必须清楚地指出所有细胞类型及其所占的百分比。各实验室可以选择将其中一些类别进行分组报告或分开报告。例如，反应性间皮细胞与单核/巨噬细胞很难区分时，在不影响临床解释的前提下可将这些细胞合并为一类。非造血细胞，如脑脊液内衬细胞和转移性肿瘤细胞，可归为 “其他细胞”类别，并在报告的解释部分进行描述。 其他重要的形态学发现也应在解释部分进行报告，如查见细胞内或细胞外病原微生物、红细胞吞噬细胞或含铁血黄色吞噬细胞(CSF)、脂质吞噬细胞(CSF)、结晶和纤毛上皮细胞(支气管肺泡灌洗液)。 污染细胞不应包括在分类中，如果在计数时可将污染细胞识别出来，也应从细胞计数中排除。这些污染细胞包括鳞状上皮细胞、内皮细胞、神经外胚层细胞(CSF)、软骨细胞(CSF、关节腔积液)和纤毛上皮细胞(支气管肺泡灌洗液)。退化细胞除非特征十分明显，否则分类计数时也应排除。 成堆内衬细胞、生发基质细胞或肿瘤细胞应在解释部分进行报告，无需再分类。同样，计数池中的细胞团块不计数在细胞总数中。 如果细胞无法识别，可报告为“非典型细胞”并进行描述，等待执业医师审核(见8.4)。 一些实验室可能倾向于对细胞组成进行半定量描述性报告，特别是当细胞计数低，载玻片上的细胞数较少时。 细胞计数较低时，恶性细胞的检出率也降低。因此，在已知或怀疑恶性肿瘤的病例中，重要的一点是要仔细观察所有玻片。 8.4医师回顾 有资质的医师应对所有含非典型未鉴定细胞或疑似恶性肿瘤细胞的玻片进行回顾。各实验室应确定额外的形态学发现和/或需要医生复查玻片的临床情况。 分装于不同等分的体液标本通常会同时在血液学或中心实验室以及细胞病理学实验室进行分析。实验室应制定相关政策，将这些结果联系起来，特别是当鉴定出非典型或恶性细胞时。当首次在Romanowsky染色的细胞离心涂片上怀疑非造血肿瘤细胞时，可采用PAP染色的细胞病理学检查进行验证。 8.5结果报告 有核细胞分类以常规单位(%)或国际单位(比例，或%/100)报告。计数的细胞数只有在计数少于100个时才包括在报告中。如果需要绝对计数，则将有核细胞数乘以百分比再除以100；绝对计数以常规单位或国际单位报告。 解释性报告部分可增加包括其他有临床意义的形态学发现。如果实验室怀疑恶性肿瘤(例如，来源于有肿瘤病史的患者样本)，特别说明有无恶性细胞对临床也是有帮助的。但重要的是，在之前未诊断恶性肿瘤的患者中，体液分类计数并不是合适的筛查或诊断肿瘤的方法。如果未进行分类计数，解释性报告部分可包含关于细胞组成的描述性说明（如体液是以淋巴细胞、单核/巨噬细胞或中性粒细胞为主，还是含有混合炎性细胞）。 报告中也应注明医师已回顾玻片。 译者说明： 本部分内容中提到的Romanowsky-type stain指的是一种类似于瑞氏染色的染色技术。Romanowsky类染料由亚甲蓝和/或亚甲蓝氧化产物（天青B）和卤化荧光素（通常为伊红B或Y）组成。ICSH推荐的血涂片染色标准方法是Romanowsky染色，该染液的主要成分是天青B（含量超过80%）和伊红Y；由于天青B价格比较贵，该法难以普及。我国采用的大多是Romanowsky染色基础上改进后的瑞氏染色和瑞氏-吉姆萨染色法。 本部分主要是关于体液细胞的形态学评估，介绍了细胞涂片离心法及制备合格涂片的注意事项；体液中各种常见细胞的形态学特征和识别要点，包括红细胞、髓系细胞、淋巴系细胞、单核/吞噬细胞、脱落细胞（脑脊液、浆膜腔积液及关节腔积液）、恶性肿瘤细胞、其他污染的上皮细胞以及病原微生物（细菌、真菌、寄生虫），最后介绍了有核细胞分类的评价和报告要求。同时展示了一些体液中常见的细胞类型举例。 由于译者水平有限，可能会出现不通顺之处或有歧义之处，欢迎大家批评指正！ * 附：体液中常见的细胞类型举例：图示翻译 嗜酸性粒细胞（脑脊液） 肥大细胞（腹水） 中性粒细胞自溶（关节腔积液） 中性粒细胞自溶（腹水） 淋巴细胞（脑脊液） 反应性淋巴细胞（胸水） 浆细胞（腹水） 巨噬细胞（脑脊液） 巨噬细胞（胸水） 巨噬细胞（印戒样细胞，胸水） 吞噬红细胞的巨噬细胞（胸水） 吞噬红细胞和含铁血黄素颗粒的巨噬细胞（胸水） 吞噬中性粒细胞的巨噬细胞（腹水） 吞噬脂质的巨噬细胞（脑脊液） 吞噬尿酸钠结晶的巨噬细胞（关节腔积液） 吞噬含铁血黄素的巨噬细胞（脑脊液） 吞噬含铁血黄素和橙黄血质的巨噬细胞（脑脊液） 脑室内衬细胞（脑脊液） 脑室内衬细胞（脑脊液） 脑室内衬细胞（脑脊液） 间皮细胞（心包腔积液） 反应性间皮细胞（胸水） 间皮细胞（胸水） 间皮细胞（胸水） 双核间皮细胞（胸水） 有丝分裂的间皮细胞（胸水） 间皮细胞（外周空泡，腹水） 原始细胞（急性淋巴细胞白血病，脑脊液） 淋巴瘤细胞(弥漫性大细胞淋巴瘤，脑脊液) 非造血系统恶性肿瘤(卵巢腺癌，腹水) 非造血系统恶性肿瘤(乳腺腺癌，胸水) 非造血系统恶性肿瘤(乳腺腺癌，脑脊液) 非造血系统恶性肿瘤(卵巢腺癌，胸水) 非造血系统恶性肿瘤(卵巢腺癌，腹水) 软骨细胞（脑脊液） 神经组织（脑脊液） 生发基质细胞（脑脊液） 似酵母菌（白色念珠菌，腹水） 似酵母菌、真菌（新生隐球菌，脑脊液） 寄生虫(弓形虫滋养体，腹水) 脑脊液中的隐球菌。注意似酵母菌的深嗜碱性。菌体周围可见一圈荚膜，瑞氏染色。 关节腔积液中的尿酸钠结晶。注意晶体呈细长的针状和明亮的双折射性。晶体在细胞内。偏振光。 关节腔积液中的尿酸钠结晶。注意红色背景下，垂直晶体的蓝色和平行晶体的黄色。一阶红色补偿器。 关节腔积液中的焦磷酸钙结晶。注意：晶体可为矩形或菱形。有些晶体也可能是针状的，易与尿酸钠结晶相混淆。明视野下观察。 End |
|
|
