合成生物学复习纲要（1.0 修订）

e1fcr38dy5cn9y 2023-03-20 发布于湖北

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导语

针对合成生物学这一门学科的学习，up我将根据李春教授《合成生物学》以及自己所学从合成生物学的定义和研究内容与方法（绪论部分），合成生物学原理，合成生物系统的基因线路，合成生物系统的设计、组合与优化，合成生物学使能技术、无细胞合成生物系统这六个部分出发制定本次复习提纲，合成生物学的应用部分这部分也不做介绍。

注：本复习提纲为Up个人总结观点，如有错误还望大家指正修复，并且关于合成生物学的计算机建模辅助这一部分内容由于我们纯生物专业大家有兴趣自己去了解变化，本次up不作介绍了。

一、绪论

定义：合成生物学是一门基于工程学理念（抽提、解耦、标准化），综合多门学科，围绕设计、构建、验证和再学习的过程（即设计与重设计），采用标准化的生物元件和基因线路，在理性设计原则指导下组装并合成具有特定功能的生物系统或改造现有生物系统、甚至是创造人工生命的新兴学科。其不同于传统基因工程以及代谢工程等学科之处便在于对生物系统研究的去耦合、标准化以及模块化。

研究策略（即如何将生物系统抽提（分离复杂的生物系统，使研究内容模块化）、解耦（复杂的问题简单化）以及标准化）：自上而下：主要用于分析阶段，利用抽提和解耦的方法降低天然生物系统的复杂性，建立工程化的标准模块；自下而上：利用标准化模块，由简单到复杂重新构建具有期望功能的生物系统。

研究范畴：① 人工合成生物基因组（即合成基因组）；② 生物基因组的简化和重构（最小化）；③ 遗传或基因线路的设计与构建；④ 合成代谢网络生产药物与生物基产品或材料；⑤ 人工合成生态系统（多细胞体系）；⑥ 无细胞合成生物系统。

因为合成生物学本身便是在基因工程以及后来的代谢工程的基础上进一步发展而来，所以尤其要注意一下其与基因工程的区别。

基因工程：又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。

与传统基因工程的区别：

① 基因工程涉及的基因组数目较少，也更少利用计算机或数学手段进行分析，而合成生物学则是对多组基因甚至整个基因组的改变、设计到网络分析、计算机模拟等，即研究基因数目和规模上，合成生物学更为广泛全面；

② 合成生物学更多的是利用标准化生物元件对现有的基因线路或系统进行改造和重构，构建的生物系统是能够高度可预测的，而传统的基因工程虽然同样也利用元件开构建工程化系统，但缺少标准化和模块化等工程化的理念，组装时常常产生不可预计的后果。

二、合成生物学原理

之前便以及介绍过合成生物学最基础的便是建立生物模块的标准化，这一章便在于给介我们绍合成生物学的标准化模块，层级化结构，基本逻辑结构以及工程化的设计原理即特点。

生物积块（Biobrick）的标准连接方法及其原理：

原理：利用同尾酶具有识别不同酶切位点，但却能产生相同的粘性末端的能力。

连接方法及过程：首先，生物积块具有相同的前缀（包含EcoRI和XbaI酶切位点）和后缀（包含SpeI和PstI 酶切位点），通过分别对含有生物积块的供体载体与需连接的受体载体用SpeI与EcoRI和EcoRI与XbaI（或SpeI与PstI和XbaI与PstI）进行酶切，其中XbaI 和SpeI 为同尾酶；其次，将生物积块连接到受体载体上；最后，将对连接好的质粒经过特殊的遗传工程手段处理，确保最终编码序列中不包含这四个酶切位点。

合成生物学的层级化结构：生物元件→ 生物装置→ 生物系统

生物元件是指具有一定功能的DNA序列，是最简单最基本的生物积块；具有不同功能的生物元件按照一定的物理或逻辑关系相互连接组成复杂一些的生物装置；不同功能的生物装置协同运作即可构成更为复杂的生物系统；具有不同功能的生物系统彼此间相互通信、互相协调可以进一步构建更为复杂的多细胞或细胞群体生物系统。

合成生物系统的基本逻辑结构：

串联：把元件逐个顺次连接起来组成线路，其上游模块的输出信号后可以作为下游模块的输入信号。

并联：多个串联结构的并行，有一条以上的相互独立通路。

单输入结构：只有一个主模块作为下一层模块的输入。

多输入结构：具有多个主模块作为下一层模块的输入。

前馈：上游基因通过2条不同途径影响下游基因的控制结构。

反馈：系统的输出会反过来影响系统的输入。

工程化设计原理：设计、构建、评估、优化的循环

三、合成生物系统的基因线路

明白合成生物学原理之后，这一章将根据逻辑结构将介绍一些模块化的基因线路。

基因线路的类型：

逻辑门基因线路：模拟各种逻辑关系和数字元件的遗传路线。包括“与”门（AND gate）基因线路、“或”（OR gate）门基因线路、“非” 门（NOT gate）基因线路、“与非”门（NAND）基因线路和“或非” 门（NOR gate）基因线路。

其他功能基因线路：是具有特定生物功能的基因线路，主要是利用基因模块原有的功能，设计全新的基因线路，并利用基因重组、基因克隆等手段对现有的生物系统进行改造，使生物系统具有特定功能。包括开关基因线路、振荡器、计数器等。

逻辑门基因线路类型以及原理：

①“与”门基因线路：输入信号全为“真”时，才输出“真”信号。

②“或”门基因线路：输入信号有一个为“真”时，输出即为“真”。

③“非”门基因线路：是输入信号为“假”时，输出即为“真”。

④“与非”门基因线路：先进行“与”门运算，再对“与”门运算的结果进行“非”门运算。

⑤“或非”门基因线路：先进行“或”门运算，再对“与”门运算的结果进行“非”门运算。

其它功能基因线路类型以及原理：

转换开关：类似于“非”门逻辑门运算，即输入为低时，输出为高；反之，输入高时，输出为低。

双相开关：对基因的转录既有正调控作用又有负调控作用。
核糖开关：通过RNA构象的改变对转录水平或翻译水平进行调控，以此阻止或开启目标基因的表达，从而实现“开关”的功能。主要由感受外界配体的适配体域和调控基因表达的结构域两部分组成。

核糖开关的应用相当广泛，举例：利用核糖开关在细菌中存在的广谱性以及调控的基因通常为致病性的关键基因，可作为抗生素开发的新靶点；通过设计核糖开关使其适配体域对菌体内的代谢物浓度快速响应，从而使核糖开关构象发生变化，进而将信号进行下一步传递，最终实现代谢物高产菌株的改造。

双稳态开关：可通过人为调控实现基因线路在两种不同稳定状态之间的切换。

四、合成生物系统的设计与组装

前面介绍了合成生物学的基本原理以及生物元件、模块化的一些基因线路，而这章将模块上升为生物系统，详细介绍如何设计、组装以及优化合成生物系统（生物系统的设计其实就是根据功能来设计基因线路，所以本章直接从组装开始介绍复习）。

合成生物系统的组装与构建：

转录单元（模块）的合成组装 → 多基因代谢途径的组装 → 染色体和基因组的组装 → 合成生物系统的组装

转录单元的合成组装方法：

限制性内切酶依赖的组装技术（通过粘性末端以及T4连接酶连接）：BioBrickTM、BglBrick（即之前生物积块的标准连接方法）和Golden gate
同源序列依赖的拼接技术（通过同源末端的同源重组实现）：In-FusionTM无缝拼接试剂盒（源于 Gibson assembly）、SLIC和Gibson等温一步法(Gibson assembly)

Golden gate: 利用TypeⅡS型限制性内切酶（识别位点在切割位点上游，如BsaI），然后通过人为设计将含有特定粘性末端的目的片段连接到载体上，实现无缝克隆。

Gibson assembly: 利用设计的引物在所需连接的目的片段两端中引入同源序列，然后通过T5核酸外切酶降解DNA，从而产生可以互补配对的3’端突出同源末端，之后再通过DNA聚合酶和连接酶完成片段的拼接。

SLIC（sequence and ligation-independent cloning）：利用PCR扩增和在缺少dNTP时T4DNA聚合酶表现核酸外切酶活性，从而产生互补配对的5’端突出同源末端，然后通过RecA介导的同源重组或者不依赖于RecA的单链退火实现片段的拼接。

多基因代谢途径的构建（除了以上介绍的方法以外，还可以通过TAR、DNA assembler方法进行代谢途径的组装）：

TAR（DNA assembler与其最终都是通过酵母的同源重组系统实现，原理很相似，所以便只介绍下TAR）：通过TAR载体将设计好具有同源末端的多个目的片段共转染到酵母中，利用酵母体内的同源重组系统实现多个片段的无缝有序拼接。

合成生物系统的构建组装：

构建的生物系统可分成部分的（也就是多基因代谢途径）或 全部的（即全基因组）

多基因代谢途径：可以通过化学/电击/原生质体转化、接合转移等手段导入底盘细胞，复制型载体（游离）或整合表达；

全基因组：需要实现对这些DNA的移植和复活，才能最终实现合成生物系统的构建。两种构建形式。（对全基因组的构建存在两种形式，即直接从头合成组装和逐步替代原有基因组）

以蕈状支原体和酿酒酵母的人工染色体就是用的两种不同构建形式：

蕈状支原体采取的是从头合成的构建方式，即通过TAR重组技术将合成的小片段分多步组装成蕈状支原体全基因组，并最终还需要通过原生质体融合完成全基因组的复活；酿酒酵母全基因组采取逐步替代的构建方式，即通过酵母的同源重组系统，直接利用合成的序列逐步替换其原有序列，最终完成全基因组替换构建以及复活。

合成基因组复活

        1. 以冠状病毒合成基因组为例，可通过体外转录（T7 RNA聚合酶）将基因组cDNA转录成RNA，通过转染细胞最终形成有功能的病毒颗粒；
        2. 原生质体融合：比如现有的在酵母中组装完成的原核生物基因组（生殖支原体、蕈状支原体等）都是通过原生质体融合来实现合成基因组的移植和复活的。
        3. 利用目的生物体本身的同源重组系统，直接利用合成的序列替换其原有的野生型序列（筛选标记迭代替换），（剔除或更换原有基因组）完成生物系统的构建和复活。

合成生物系统构建后一般都无法直接达到理想的功能状态，还需要进行很多其他后续的优化，包括增加底物供应、提高代谢途径中酶的表达量、优化调控代谢途径的因子、对途径中关键酶的改造优化以及敲除竞争性途径等

合成生物系统的优化：

优化的主要层次可分为三层：单一基因的优化、多基因途径的组合优化以及基因组的简化和重构。

① 单一基因的优化：利用不同的调控单元（包括启动子、RBS、终止子以及核糖开关等）从转录、转录后和翻译水平等不同层次实现基因表达水平的优化。
② 多基因途径的组合优化：对合成生物系统特定代谢途径（内源或外源）进行组合优化。根据优化策略的不同还可分为理性优化和非理性优化。
③ 基因组的简化和重构：通过对基因组中的冗余基因进行敲除重构，使细胞具有较为明确的调控网络。
单一基因的优化：

① 启动子：活性差异很大，可分为组成型表达和诱导型表达两大类。组成型启动子提供较为恒定水平的基因表达；诱导型启动子可以控制基因的表达时间和表达量，适用于对细胞造成不良影响的基因表达。使用诱导型启动子应考虑：
a. 经济代价；b. 启动子对诱导剂的敏感度；c. 诱导时间；d. 不存在诱导剂时的背景表达。

人工合成启动子：除天然启动子以外，可通过突变文库（如易错PCR或饱和突变）的高通量筛选或人为设计来开发合成型启动子。通过智能学习，还能去设计一定强度的人工启动子。

② 终止子：mRNA转录的终止和mRNA的半衰期具有重要调控作用，也存在野生型和人工型的终止子。
③ RBS：RBS序列的亲和力和数目可以调控核糖体招募到RBS上的速率和翻译起始的效率，现已开发了一些RBS的设计软件，如RBS calculator和 RBS designer。

多基因途径的优化（可分为理性优化以及非理性优化）：

对合成生物系统特定代谢途径（内源或外源）进行组合优化是提高特定产物或生产全新的产品的关键步骤。最佳的多基因途径需要平衡途径中各个酶的活性以获得最大产量并避免累积中间代谢物，特别是有毒的中间代谢物。

非理性优化：由于细胞代谢的高度复杂性，并且对大多数代谢途径认识理解的有限性以及缺乏前瞻性的设计标准，可以采用非理性优化进行多基因途径的组合优化。诱变筛选或genome shuffling。

基因组改组技术（Genome shuffling）：利用原生质体融合技术，通过经典的诱变育种方法获得多个性状得到提高的菌株，构建突变体文库，以这些性状明显提升的菌株首轮多亲本融合的直接亲株，然后进行多亲株融合，使其全基因组进行随机重组，获得第一代融合株；再从中选择表型进一步提高的菌株作为下一轮融合的直接亲本，以此类推，进行多轮的多亲本融合，最终从获得突变体库中筛选出性状提升的目的菌株。

理性优化：随着研究的深入，尤其是转录组、代谢组和蛋白质组等分析，可以为途径限速步骤的有害中间体的寻找提供帮助。通过对途径关键酶类的转录水平的组合调控（用底盘特异的不同强度的启动子突变体对代谢途径进行从头装配，结合后续的高通量筛选技术），可以实现代谢流量的平衡，从而定制优化目标代谢途径。

人工蛋白骨架：通过构建一条蛋白骨架，将改造后带有识别并结合该蛋白骨架结构域的目标代谢途径中的酶按一定比例富集到一起，从而形成一种多酶复合体结构，以此来提高酶与目标靶分子相互作用的概率并使代谢流能朝预期方向流动。

优势：避免代谢物中间体损失（扩散或被竞争途径利用）；保护不稳定中间体免受细胞溶剂的伤害，降低代谢中间体的运输时间；规避代谢物浓度不足造成的不利平衡和动力学。

区室化：根据真核细胞中不同亚细胞结构中存在的PH、能量、离子、代谢途径等的不同，将目标代谢途径中的某些步骤靶向到特定亚细胞结构中进行，从而提高目标产物的生产效率。

优势：避免竞争途径造成的干扰；增加代谢中间体合成酶的活性以及前体原料浓度。

动态调控：利用诱导型启动子、生物传感器、细胞群体感应等装置的构建，平衡细胞生长与目标代谢物生产之间的矛盾，根据调控方式的不同可分为途径依赖的与非途径依赖的，前者是对细胞代谢与生产关键节点间进行相互监测、反馈控制；而后者则是通过细胞之间的群体感应系统来实现细胞生长与靶基因表达之间的平衡。

优势：使细胞有足够的的能量和物质进行高效生产；保证了生产的稳定性以及可持续性；在不同的途径中都具有广泛的适用性和可实现。

基因组具有冗余性，冗余基因的敲除通常不会对生命体的存活造成影响。基因组中的基因可以划分为必需基因和非必需基因两大类，非必需基因的敲除将有助于简化基因组；基因组的精简化可以避免不必要的能量和物质消耗，使细胞具有较为明确的调控网络，从而有利于更具后续需求有目的性地改变生命体的性状；

简化版底盘细胞的构建策略和方法：

① 运用比较基因组学，预测出细菌基因组上核心必需基因和非必需基因；

② 通过高频高效转座子插入突变筛选必需基因以及非必需基因；
③ 通过大片段基因缺失技术，将非必需基因予以敲除。

选择底盘细胞的要求：

1）遗传可操作性和稳定性，高效的DNA转化系统和同源重组效率（整合表达、基因组编辑）；
2）具有特征明确且可控的调控元件，包括启动子、终止子、转录调控开关等。开发定量化、模块化和标准化的功能模块；
3）各种组学分析的工具和算法，有助于对细胞在不同操作和环境下；进行各种组学特性的表征；清晰的组学表征和调控网络将有助于根据目标产物的特性对底盘的适配性进行评价和优化。
4）能够在含有廉价碳源的基础培养基上生长，比如可以同时利用己糖和戊糖，使木质纤维素生物质中的所有糖组分都可以转化成所需的产物；
5）生长周期短，能够在短时间内实现生物个体的快速增殖和目标产物的生产；
6）代谢率高，快速高效的代谢速率是高生产率和高转化率所必不可少的；
7）发酵过程简单，降低操作成本和最大限度地控制大规模生产的风险；
8）具有强大的环境适应性，尽可能耐受生产过程中的高温、低pH等不利条件以及生物质预处理过程中的抑制剂等；
9）对高浓度底物和产物具有耐受性。

功能模块与底盘适配性分析与评价

合成的任何一个功能模块都需要一个合适的底盘来帮助其实现预设的生物学功能。模块功能的发挥需要使用底盘的资源并受到底盘的调控，但同时也会干扰、影响底盘的状态。因此，功能模块与底盘的适配性分析与评价十分重要，功能模块与底盘的适配性直接影响甚至决定了功能模块的功能发挥及其发挥程度。

从四个方面进行分析评估，分别是：

① 底盘的生存形式与细胞状态是否适合功能模块的发挥，底盘是否能在最终的应用条件下存活？

② 外源功能模块是否会与底盘的内在组成发生相互作用，即二者是否正交？模块功能的发挥是否会对底盘产生毒害作用？

③ 细胞的代谢状态是否能够为模板功能的发挥提供足够的物质和能量支持？是否存在模块发挥功能所需要的前体物质和辅因子等？

④ 外源功能模块是否可以在底盘中稳定存在？

人工体系的优化

如何实现人工体系运行效率的最优化是合成生物学发展的一个重要议题。主要通过对人工体系和底盘细胞两个方面对人工体系运行效率进行最优化。

建立全细胞代谢模型，对代谢流进行可控调节，使其对细胞的物质和能量（代谢物\ATP\氨基酸、转录和翻译机器等）进行重新分配

基因组精简：减少底盘不必要的物质和能量消耗，并减少对人工体系的干扰。

酶的定向进化 ：在酶蛋白基因水平上尽可能多地人为造成随机突变或重组，形成一个庞大的基因突变库，然后在基因表达出相应的酶蛋白突变体库。在人工模拟恶劣环境或要求下（比如高温、高毒性）从酶蛋白突变体中定向筛选出具备理想性状的酶蛋白突变体（比如高活性、高选择性、高稳定性等）。从筛选出的酶蛋白突变体中提取基因，并作为母本，进入下一轮酶基因突变库建立，实现酶的进化。

定向进化的方法有Genome shuffling(上文又提），SCRaMbLE

SCRaMbLE: 在合成基因组中引入的人工设计的可诱导型进化系统，可以在诱导Cre重组酶表达的情况对合成基因组进行随机重组，从而在极短的时间内产生大量不同基因组成的基因组。

五、合成生物学使能技术

这一章便是介绍使合成生物学成为可能的技术。

DNA合成技术:

    ① 柱式寡核苷酸合成：利用固相亚磷酰胺化学合成法，通过去保护、偶联、加帽和氧化4个反应的循环往复进行寡核苷酸的合成。
    ② 微阵列介导的DNA合成：在微阵列芯片上通过固相亚磷酰胺化学合成法一次同时合成大量的寡核苷酸。

DNA组装技术：BiobrickTM，Golden gate，SLIC，Gibson assembly TAR（之前在第三章都已经介绍过）

基因组编辑技术：λ-Red同源重组，Cre/loxP基因组编辑系统，位点特异性重组，ZFN，TALEN CRISPR/Cas9/Cpf1（这里主要介绍λ-Red同源重组，位点特异性重组，CRISPR/Cas9）

λ-Red同源重组：利用λ噬菌体的Redɑ/Redβ重组系统，即通过Redɑ切割使插入片段与载体之间产生可以互补配对的突出同源末端，然后在Redβ的引导下发生同源重组，从而实现在目的位点的基因编辑。

Cre/loxP基因组编辑系统：利用Cre重组酶可以识别loxP位点，引发loxP位点的DNA 重组从而实现基因编辑的一项技术。

位点特异性重组：这类重组依赖于小范围同源序列的联会，重组也只发生在同源的短序列的范围之内，即attP和attB位点，重组时发生精确的切割、连接反应，DNA不失去、不合成。将一个DNA分子整合到另一个DNA分子上（插入重组）。

CRISPR/Cas9：CRISPR/Cas系统是细菌或古菌体内的获得性免疫系统，可通过crRNA引导Cas蛋白切割外源DNA或RNA，使细菌或古菌对外源侵入的病毒、DNA或质粒等产生免疫。由两大部分组成: 第一个部分是编码Cas相关蛋白的基因，在获得外源基因片段和剪切外源基因上都起着重要的作用；第二部分为具有规律成簇的间隔短回文重复DNA序列的CRISPR，起着引导Cas相关的蛋白去剪切目的核酸序列的作用。

工作原理：首先将设计好的一段crRNA插入CRISPR簇正确位置中，然后其转录的 crRNA便可通过碱基配对识别附近具有PAM序列的目的核苷酸序列，然后通过crRNA上的repeat序列通过碱基互补与 tracrRNA结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。

碱基编辑器ABE、CBE以及GBE：

ABE：通过nCas9锚定到靶序列处，然后利用通过定向进化得到的可对DNA中腺嘌呤进行脱氨的TadA与产生的ssDNA结合，将靶区域内的腺嘌呤脱氨变成肌苷（或次黄嘌呤或黄嘌呤），然后其会被当做G进行读码与复制，最终实现A/T碱基对至G/C碱基对的直接替换。

CBE: 通过nCas9锚定到靶序列处，然后利用脱氨酶APOBEC1将靶区域内的C脱氨形成U，同时通过尿嘧啶DNA糖苷酶抑制子（UGI）抑制尿嘧啶DNA糖苷酶（UNG）的活性，然后便可以U的形式进行修复与复制，最终实现 C/G碱基对至T/A碱基对的直接替换。

GBE: 通过nCas9锚定到靶序列处，然后利用脱氨酶APOBEC1将靶区域内的C脱氨形成U，同时选择增强尿嘧啶 DNA 糖苷酶（UNG）去除U碱基的这个过程，从而基本抑制了C到T这个过程，并使得C到G变成了主要的碱基编辑方式，最终实现C/G碱基对至G/C碱基对的直接替换。

先导编辑（prime editing）: 通过Cas9锚定并剪切靶序列，然后利用逆转录酶(RT)与设计好的逆转录模板pegRNA实现特定位点的突变。
相较碱基编辑器的优势：无需DSB或DNA模板即可进行精确的靶向插入，缺失和所有可能的点突变类别。

CRISPRi : 基于ddCpf1，即保留Cas蛋白靶向目标序列的能力，而破坏了Cas蛋白核酸内切酶的活性（如dCas9），从而起到抑制靶基因表达的功能。

CRISPRa ：有两种策略，（1）将激活蛋白通过一段肽链或支架蛋白将其直接或间接与dCas9蛋白相连，从而激活特异靶基因的表达；（2）通过在gRNA上连接scRNA（scaffold RNA），形成scRNA-dCas9复合体，然后利用scRNA招募对应的激活蛋白，从而实现特异靶基因的表达。

CRISPR/Cas酶辅助的TAR基因簇克隆技术：CRISPR/Cas酶辅助的TAR基因簇克隆技术利用CRISPR/Cas系统对目的片段两端进行特异性切割，然后与TAR载体一同导入宿主酵母中，通过酵母的同源重组系统实现拼接。

优势：相较之前提到的TAR，此技术可实现基因组的直接克隆与多基因的同时高效编辑。

核酸分子诊断技术：重点介绍SHELOCK 以及RPA（等温扩增）

RPA（等温扩增）：

能结合单链核酸的重组酶与引物结合形成的蛋白- DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，通过链置换DNA聚合酶就会发生链置换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB（单链DNA结合蛋白）结合，防止进一步替换。