关于细胞转染，你知道多少？

细胞转染是什么？

细胞转染是指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术。随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展，转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规工具。在研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验中，其应用越来越广泛。

技术内容：将外源分子如DNA,RNA等导入真核细胞 
研究内容：研究和控制真核细胞基因功能 
应用：基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验

细胞转染可分为？

1、瞬时转染：外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其他调控原件的分析。一般来说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后24-72小时内分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来帮助检测。
目的：快速分析
筛选方法：抗生素抗性
表达持续时间：随细胞分裂而稀释至丢失48－72小时 
目的DNA与宿主染色体：未整合

2、稳定转染：外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整个率高。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1、104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶，潮酶素B磷酸转移酶，胸苷激酶等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。
目的：为获得稳定表达外源基因的单细胞克隆 
筛选方法：抗生素抗性
表达持续时间：随宿主细胞本身基因组一样复制，转录，翻译，并被稳定遗传 
目的DNA与宿主染色体：未整合

细胞转染方法？

1、DEAE-葡聚糖法
是最早应用哺乳动物细胞转染的试剂之一。DEAE-葡聚糖是阳离子多聚体,它与带负电的核酸结合后接近细胞膜而被摄取。DEAE一葡聚糖转染已成功地应用于瞬时开始，但用于稳定转染却不可靠。
2、磷酸钙共沉淀转染法
由于试剂易得、价格便宜而被广泛用于瞬时转染和稳定染的研究。方法是，先将DNA和氯化钙混合，然后加人到PBS中慢慢形成DNA磷酸钙沉淀，后把含有沉淀的混悬液加到培养的细胞上，通过胞膜的内吞作用摄人DNA。
3、脂质体介导法（目前应用最广泛）
原理：阳离子脂质体试剂与DNA混合后，形成一种稳定的脂质双层复合物，DNA被包在脂质体中间，这种脂质双层复合物可直接加到培养的细胞中，脂质体粘附到细胞表面并与细胞膜融合，DNA被释放到胞浆中。
【主要应用】:瞬时转染  稳定转染. 
【特点】：使用方法简单，可携带大片段DNA，通用于各种类型的裸露DNA或RNA，能转染各种类型的细胞，没有免疫原性。虽在体外基因转染中有很高的效率，但在体内，能被血清清除，并在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应，导致高水平的毒性，很大程度上应用受限制。
4、物理方法(电穿孔、显微注射及基因枪)

下面以脂质体介导法给大家作为讲解

脂质体介导法

一、材料
293T细胞

MyoD表达质粒和EGFP表达质粒

DMEM培养基

链霉素/青霉素（双抗）

FCS（小牛血清）

PBS（磷酸盐缓冲溶液）

胰酶/EDTA消化液

转染试剂（TransFast

二、器材
20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip头
酒精灯
废液缸
血球计数板
涡旋振荡器
恒温水浴箱
台式离心机
35mm培养皿
转染管
15ml离心管
观察用倒置显微镜
荧光显微镜和CCD

三、 实验步骤

1、细胞传代

（1） 试验准备：200ul/1mlTip头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。

（2） 弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。

（3） 用Tip头加入1ml Trypsin液，消化1分钟（37℃，5%CO₂ ）。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。

（4） 加入1ml的含血清培养基终止反应。

（5） 用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。

（6） 将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。

（7） 用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X10⁶个细胞加入一个35mm培养皿。

（8） 将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。

（9） 将培养皿转入CO₂培养箱中培养，第二天转染。

2、细胞转染

（1）转染试剂的准备

A. 将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。

B.震荡后将试剂放在-20℃保存，使用前还需震荡，。

（2） 选择合适的混合比例（1：1-1：2/脂质体体积：DNA质量）来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。

（3） 将混合液在室温放置10-15分钟。

（4）  吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。

（5） 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。

（6） 到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24-48小时。

3、第二次细胞传代

（1） 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。

（2） 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X10⁵个细胞/35mm培养皿将细胞重新粉入培养皿中。

（3） 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。