柱层析技术: 如何过好手动柱！

       自从有了Flash过柱机，身边很少人采用手动过柱了，手动柱目前还是多存在于高校。回忆起自己的求学路上，过手动柱是日常工作。过手动柱可以说是科研打工人必经之路，柱层析用来分离纯化产物。下面分享一下自己使用手动柱的过柱过程及一些注意事项，仅供大家参考。

一、手动柱过柱过程​

1. 分析样品: 明确样品数量和样品在TLC上分离度(Rf)，以及样品溶解性等。

2. 硅胶固定相: 确认硅胶数量的大致用量，常为样品量的30-70倍，很难分离的可以使用100倍。

3.选择柱子: 根据硅胶用量一般为柱长的四分之一到二分之一，实验室常用15cm左右即可，选择合适规格的柱子。

4.硅胶装柱: 

a. 湿法装柱是先把硅胶用适当的溶剂拌匀后，再填入柱子中，然后再加压（用小鱼泵加压或是用氮气加压)。当然不加压也可以，用淋洗剂'走柱子'，本法最大的优点是一般柱子装的比较结实，没有气泡。

b. 干法装柱则是直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打柱子两侧（湿法也要敲的，效果好点），至硅胶界面不再下降为止，然后再填入硅胶至合适高度。大柱子可以用油泵直接抽，这样就会使得柱子装的更结实。

5. 上样: 也是有湿法，干法上样，湿法可用小极性溶解上样，干法则为拌样。

个人喜欢干法上样，一般样品和硅胶按 1：1 的量混合， 硅胶使用的量也可以少一些， 但是要保证在旋干后， 不能看到明显的固体颗粒，让样品都吸附在硅胶的表面上。

6. 添加保护层:常用无水硫酸钠，高度大概1-2cm即可，防止上样层被破环。

7. 润柱: 用小极性溶剂润柱一个柱体积即可，特别是干法装柱，要好好润柱，使得硅胶恢复室温，后续不易产生气泡。

8. 淋洗液洗脱: 根据待分离物质TLC中Rf值为0.2-0.3的展开剂比例，保守一点放大10倍开始洗脱，激激进一点可以8倍开始洗脱，很多产品大致在3-5倍则可拿到产物，根据分离度Rf设置若干个梯度，每个梯度大致冲个两三个柱体积即可。

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9. 加压过柱是一种比较好的方法与常压柱类似， 但用外加压力可以使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵 （用鱼缸供气的加压泵就行），特别是在容易分解的样品的分离中很适用。此外还有减压过柱，和常压过柱。

10. TLC监测: 洗脱过程，实时检测点板，直到拿到你想要的产物点即可。

11. 旋蒸: 产物洗脱液确认后，浓缩得到产品，可以送相关数据表证。

二、过柱子注意事项 ⚠️ ⚠️ ⚠️

1. 在没有确定你的产物在哪几根试管之前，千万别乱扔试管，更别急着扔掉柱子，这也是一项打工人禁忌。

2. 手动过柱一定要有些耐心，一排排试管点板TLC查验下来。对于可能是产物的试管，还需要打LC-MS或者打个核磁再确认一次。

3. 一般是用硅胶，硅胶注意目数，目数越高，代表硅胶颗粒越细，分离效果就越好。

4.如果TLC时出现长拖尾，根据是含羧基还是氨基，展开剂（洗脱剂）中加入千分之一左右的冰醋酸或者三乙胺，会有效改善拖尾的现象。

本文多为个人见解，若有不足或者错误之  处，恳请各位多多包涵或者私信交流指正！