大家上午好！今天小编和大家分享一篇22年3月发表在Front Oncol (IF:6.244)杂志的文章《Bioinformatics and Experimental Analysis of the Prognostic and Predictive Value of the CHPF Gene on Breast Cancer》。作者基于TCGA和GEO数据库，系统性地分析了CHPF基因在乳腺癌中的预后价值，并探索了与免疫微环境之间的关系。对于该思路有兴趣的老师可以与我们联系，方法适用于其他疾病。背景： 乳腺癌已成为全球女性癌症死亡的第二大常见原因。由于早期诊断技术和普及程度的限制，一些患者在发现时仍处于晚期；某些类型的乳腺癌进展迅速，治疗选择有限。因此，改善乳腺癌患者的预后，寻找新的生物标志物是亟待解决的问题。硫酸软骨素(CS)是一种硫酸化糖胺聚糖(GAG)，参与骨骼的生物合成。多项研究发现CS参与肿瘤进展和转移。CHPF参与CS链延长。它被上调并且其高表达与乳腺癌、肺癌、恶性黑色素瘤、胆管癌的不良预后呈正相关；与肝细胞癌的不良预后呈负相关。目前，尚无明确的CHPF在癌症中的作用机制。此外，关于该基因在乳腺癌中的研究很少，也缺乏额外的证据证实其在乳腺癌中的重要作用。 方法： 1，limma用来进行差异分析； 2，Kaplan-Meier生存分析； 3，T检验用于评估两组基因表达水平之间的差异； 4，WB和RT-qPCR验证基因表达水平； 5，Spearman分析基因之间的相关性； 6，单因素COX分析基因与临床特征的关系； 7，伤口愈合和Transwell和EDUC检测分析细胞增殖、迁移和侵袭； 8，clusterProfiler包用于进行GO和KEGG富集分析； 9，GSEA用于高低风险组的富集分析； 研究结果： 1.CHPF在乳腺癌中高表达并与不良预后相关 使用“limma”包对TCGA-BRCA数据库中肿瘤样本以及相正常样本进行差异表达分析，以比较肿瘤样本以及正常样本中的CHPF表达。发现CHPF基因在
乳腺癌中的表达显著上调。由于TCGA-BRCA肿瘤样本与正常样本的数量不等，因此选择了配对分析，结果显示乳腺肿瘤样本中CHPF基因表达水平显着增加。 随后进行了K-M生存分析，结果表明CHPF高表达组的预后较差；此外，我们选择GSE20685数据集进行进一步验证，得到了与TCGA相同的结果。 我们进一步利用单因素Cox分析CHPF基因和临床病理因素的关系，可以看到CHPF基因表达与预后相关并作为危险因素发挥作用。 接着，我们分析了CHPF基因在 14对肿瘤和正常组织中的表达，发现CHPF基因的表达在乳腺癌组织中显著增加。 此外，我们通过WB检测了六种乳腺细胞系中的CHPF蛋白水平。发现CHPF基因在乳腺癌细胞系MCF-7和SUM1315中显著表达，因此选择这两个细胞系进行后续研究。 2.CHPF DNA甲基化和CHPF转录表达与免疫浸润的关系
在TCGA-BRCA中，我们首先分析了CHPF基因中不同位点发生甲基化的程度。随后的相关性分析显示 CHPF 转录物表达与 cg03176520 位点甲基化呈负相关。 K-M生存分析表明，较高的 CHPF cg03176520 位点甲基化与总生存期 (OS) 和无进展生存期（PFS）相关。此外，同时具有 cg03176520 位点高甲基化和低 CHPF 基因表达的乳腺癌患者与高甲基化结合高 CHPF 基因表达组相比，总生存期显着增加。 我们进一步分析了肿瘤微环境中的免疫细胞浸润。可见乳腺癌肿瘤微环境中免疫细胞浸润程度与预后相关（P=0.011）。基于CHPF基因高表达组和低表达组的免疫细胞含量分析结果显示，两组共有10个免疫细胞存在差异（P<0.05）。相关性检验进一步分析了免疫细胞与CHPF基因的相关性，结果显示共有12个免疫细胞与目标基因相关（P<0.05）。将免疫细胞差异分析与相关分析结果相交后，共得到10个差异表达的免疫细胞，这10种差异免疫细胞的K-M生存分析显示，其中B细胞记忆、B细胞幼稚、T细胞、CD4记忆静息、巨噬细胞M0、巨噬细胞M1与生存相关，其中巨噬细胞M0、巨噬细胞M1、B细胞记忆与不良预后相关。 此外，GSCA数据库分析的结果显示，CHPF DNA甲基化与B、CD8 T/CD4 T细胞浸润水平、细胞毒性和Exhausted呈显着负相关。 3.CHPF基因表达和CHPF DNA甲基化与临床病理参数相关性分析
我们分析了BRCA患者的临床病理学参数与CHPF基因表达和甲基化之间的关系。结果显示，与≤35岁的患者相比，CHPF表达在35岁以上的患者中上调，M1期患者CHPF表达水平明显高于M0组。尽管肿瘤分期、T期和 N期亚组之间没有显著差异，但与同一组中的其他分类相比，CHPF表达在IV期、T4 和 N3 期似乎有所增加。 使用在线数据库bc-GenExMiner ( http://bcgenex.ico. )，我们研究了CHPF表达与ER、PR、HER2之间的关系，从结果中我们可以得出结论，CHPF显著存在于ER-、PR-、ER/PR-、HER2 组。 在临床实践中，这些人群往往预后较差。同时，在smartapp（ http://www./smartapp/ ）在线分析了CHPF cg03176520基序甲基化与乳腺癌肿瘤分期的关系，虽然没有阳性结果支持，但我们仍然可以看出CHPF cg03176520基序在样品中甲基化程度较低，晚期 IV 样品的甲基化程度低于其他阶段。 4.CHPF转录表达/DNA甲基化与免疫标记的相关性
我们利用TISIDB在线数据库评估了CHPF转录物表达/DNA甲基化与免疫标记物之间的关系（图 4A–J)。CHPF转录本表达与免疫调节剂弱相关，例如BTLA、CD160、CD274、CD96、IL10RB、KDR、LGALS9、PVRL2、VSIR、CD40、CD40LG、CD70、IL6R、KLRK1、MICB、NT5E、PVR、TMEM173、TNFRSF14、TNFRSF18、 TNFRSF25、TNFSF9、TNFSF13、TNFSF15、ULBP1（1 < |R| < 3）并与CD276、TNFRSF4、TGFB1（|R| > 3）密切相关。有趣的是，我们发现与CHPF转录表达和CHPF DNA甲基化显着相关的免疫相关分子总是表现出相反的趋势。 5.CHPF在体外促进乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭 由于在细胞系验证中CHPF在MCF-7细胞和SUM1315细胞中的表达高于正常乳腺细胞MCF-10A，因此选择这两个细胞系进行干扰并用靶向CHPF（S1 和 S2）的siRNA瞬时转染或分别在MCF-7和SUM1315细胞中使用siCtrl (NC)。WB和 RT-qPCR结果均表明，与对照细胞相比，CHPF siRNA转染细胞中的CHPF显著降低。与对照组相比，敲低CHPF组的菌落形成数量显著减少。在CCK8增值试验中下调CHPF表达后，MCF-7和SUM1315细胞的增殖显著降低。
EDU掺入分析显示，与对照细胞相比，CHPF干扰组中EDU阳性MCF-7和SUM1315细胞的比例显著降低。伤口愈合和侵袭试验的结果表明，干扰CHPF降低了MCF-7和SUM1315细胞的迁移能力和侵袭能力。 PF敲低的MCF-7和SUM1315细胞中下调，而E-cadherin的蛋白水平上调。 6.CHPF和ECM-受体相互作用及其与PI3K-AKT通路相关的基因表达为了进一步了解CHPF诱导BRCA转移的分子机制，我们使用TCGA-BRCA数据进行了生物信息学分析。将样本分为CHPF基因高表达和低表达两组，对两组所有基因进行差异表达分析，以|logFC|>1和FDR<0.05为筛选条件，共3个筛选出差异表达基因，即MMP11、COMP和COL6A2。GO富集分析显示，差异基因主要与细胞外基质相关项有关，这些项通常与肿瘤侵袭性相关,而KEGG通路富集分析显示差异基因主要富集在ECM-受体相互作用和PI3K-AKT通路。
ECM-受体相互作用和PI3K-AKT通路相互交联，由许多参与细胞运动和癌症转移的基因组成，这与CHPF基因的转移促进作用一致。KEGG中最显著富集的ECM-受体相互作用通路进行GSEA富集分析，结果显示该通路与CHPF基因表达呈正相关。我们使用GEPIA验证了上述3个基因与CHPF基因的相关性，结果显示，以上基因均与CHPF基因显著相关。 此外，还进行了WB以验证PI3K-AKT信号通路的关键基因。根据结果可以看出，CHPF敲低组的P-PI3K和P-AKT水平低于对照组。随后，我们选择在两组中差异表达并参与ECM-受体相互作用和PI3K-AKT通路的基因进行RT-qPCR 验证（倍数变化 > 1.5），分析了总共13个基因的mRNA水平的变化，其中10个基因随着CHPF基因的改变而改变。其中，只有COL6A2和SDC1随着CHPF敲低而显著增加。相反，COL6A2确实与GEPIA数据库中的CHPF呈正相关，这与我们目前的发现相反。
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