一株产葡萄糖氧化酶菌株的筛选、鉴定及酶学性质表征

共享2931 2023-03-24 发布于广东

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摘要：【背景】海洋中蕴藏着大量未被开发利用的微生物种质资源，而且海洋微生物所产的酶类因其具有耐低温、耐高压、耐高盐等明显区别于陆地微生物所产酶的特点而备受关注。【目的】从渤海海域海泥样品中分离筛选产葡萄糖氧化酶的菌株，并研究其酶学性质。【方法】通过平板筛选初筛和酶活复筛，确定产葡萄糖氧化酶的菌株；通过形态学鉴定和构建系统发育树分析，对产葡萄糖氧化酶的菌株进行酶学性质研究。【结果】筛选到一株产葡萄糖氧化酶菌株(31号)，经生理生化特征和多序列分析确定为担子菌属(Basidioascus sp.)；31号菌株所产葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)在 25−35 ℃温度内有较高酶活，达 20 U/mL；最适反应温度为30℃，而且在 0 ℃时仍有酶活；在pH 7.0环境下酶活性最高，在pH 5.0−7.0间活性较为稳定，酶活残余率较高；5 mmol/L 的Ni 2⁺、Na⁺和 Zn²⁺对酶活的促进作用尤其显著，5mmol/L的Mn²⁺对GOD酶活性有显著抑制作用；Cu²⁺、K⁺和Ca²⁺对酶活性有抑制作用，而且浓度越高抑制作用越显著，不同浓度的β-巯基乙醇、乙二胺四乙酸、曲拉通-100、次硫酸钠和二硫苏糖醇对GOD酶活性均有显著抑制作用。【结论】研究表明31号菌株是一株极具研究价值的产低温葡萄糖氧化酶菌株，为葡萄糖氧化酶的生产提供了良好的种质资源，为后续研究积累了相关数据，同时也填补了利用该菌生产葡萄糖氧化酶的空白。

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)欧盟系统编号为EC1.1.3.4，通常呈黄色，粉末状，易溶于水，但完全不溶于酒精、甘油、乙二醇、乙醚等有机溶剂，是一种高特异性的氧化还原酶，GOD 也是一种重要的工业用酶。在有氧的环境下，GOD可以催化 β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢，反应过程分为2个半反应且具有专一性。GOD具有脱氧杀菌且无副作用的特点，如其可以消除肠道病菌的生存环境、改善肠道酸性的消化环境、保护肠道上皮细胞的完整及解除霉菌中毒和药物中毒的毒性等。GOD 应用非常广泛，如在医药行业方面，GOD传感器现已成为检测葡萄糖的主要工具；在食品方面，GOD 可代替传统食品添加剂，在使面团松软、避免食物褐化、抑制红酒腐败和保持食品风味等方面均具有应用；GOD 在生物燃料生产方面也已取得卓越成果，为能源危机和环境污染问题减轻了压力；作为饲料添加剂，GOD具有维持肠道微生态平衡的优势。GOD可以从动植物体内分离，也可由微生物发酵产生，目前可产GOD的菌株往往来源于陆地，其中霉菌占多数。

由于我国对GOD的研究相对于其他国家起步较晚，目前我国GOD产业存在以下问题：(1)生产成本较高、产品纯度较低和产品稳定性较差；(2)研究对象来源多为陆地环境，例如霉菌和昆虫等，所产GOD属于中高温酶，而对低温GOD的研究较少。微生物具有来源广泛、生产成本低、生长周期短等优点，对微生物来源GOD的研究对象主要集中于霉菌和细菌，其中以曲霉研究最多，而对酵母菌来源的GOD研究较少，尤其是海洋担子菌属来源的GOD，目前已报道的只有刘春莹等从海洋中筛选到一株海洋担子菌。海洋约占全球总表面积的71%，海洋中蕴藏着丰富的微生物资源，由于海洋区别于陆地的低温、高压、高盐等特点，海洋微生物所产的酶类往往具有耐低温等不同于陆地微生物所产酶的明显特点。低温酶也被叫做适冷酶、冷活性酶或嗜冷酶，是一类能在低温条件下催化生化反应的酶。低温酶的最大特点是在0 ℃条件下依然具备酶活性，最佳反应温度通常低于40℃。在低温条件下低温酶催化活性很高，在实际生活或生产中具有广阔的发展前景。在已报道的研究中，GOD的最适温度范围一般为28−40℃，属中高温酶类，而且从海洋中分离的高产低温GOD的菌株很少，只有刘春莹等筛选到的一株担子菌、胡善松等筛选到的一株柠檬酸杆菌、石淑钰等得到的一株假单胞杆菌和叶日英等筛选到的一株蜡状芽孢杆菌，而且GOD酶活较低，均需提高。

本研究利用海洋微生物进行工业化大规模生产GOD具有极大的优势和潜力。本研究通过平板筛选初筛及酶活复筛，从大连地区渤海海域海泥样品中分离得到一株产低温GOD的菌株；通过形态学鉴定和分子生物学分析确定其种属；通过测定生长曲线及酶活曲线，对菌株的酶学性质进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源

中国辽宁大连渤海海域(123°371′E，39°6972′N)海泥，取样深度25−30m。

1.1.2 培养基

富集培养基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母膏5.0，NaCl 1.0，葡萄糖2.0，pH 7.2。

筛选培养基(g/L)：葡萄糖80.0，蛋白胨3.0，KH₂PO₄ 2.0，MgSO₄·7H₂O 0.7，KCl 0.5，NaNO₃ 4.0，CaCO₃ 3.5，可溶性淀粉 10.0，脱氧胆酸钠0.3，KI 1.7，琼脂 20.0。

发酵培养基/种子培养基：葡萄糖 60.0，蛋白胨 3.0，KH₂PO₄ 0.2，MgSO4·7H2O 0.7，KCl 0.5，NaNO₃ 4.0，pH 7.0。

1.1.3 主要试剂和仪器

胰蛋白胨、琼脂粉，北京阳光生物科技有限公司；酵母膏、蛋白胨、酵母浸粉、革兰氏染色液，北京奥博星生物科技有限公司；NaCl，天津市大茂化学试剂厂；葡萄糖，天津市科米欧化学试剂有限公司。低温恒温培养箱，上海艾朗实验设备有限公司；恒温摇床，上海同安医疗用品制造有限公司；电热恒温，上海精宏实验设备有限公司；酶标仪，赛默飞世尔科技公司；显微镜，Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株初筛

250 mL锥形瓶中加入100 mL蒸馏水及玻璃珠，在 103.4 kPa条件下灭菌20 min后加入10 g海泥样品，于25℃、160 r/min摇床中振荡15 min，取出后静置5 min，取1 mL上层液体加入富集培养基中，于 25 ℃、200 r/min 培养 24 h。将富集后的菌液梯度稀释，取10⁻⁴ 、10⁻⁵和10⁻⁶浓度的稀释液各80 μL分别涂布在筛选培养基上，25℃倒置培养4 d，挑取使培养基产生透明圈并变成蓝

紫色或紫黑色的菌株划线纯化。

1.2.2 菌株复筛

挑取纯化后的单菌落接种于5 mL发酵培养基中，25℃、200 r/min培养48 h。种子液以1%的接种量转接于100 mL发酵培养基中，25℃、200 r/min培养24 h，将发酵液10000 r/min 离心10 min，取上清液检测酶活。

1.2.3 菌种鉴定

(1)形态学鉴定

将酶活较高的菌株划线在固体发酵培养基上，25 ℃恒温倒置培养2 d，观察菌落形态。挑取单菌落用简单染色法进行染色，利用显微镜观察菌体形态。

(2)分子生物学鉴定

将纯化的菌株送至TaKaRa(上海)公司进行rDNA ITS鉴定。

1.2.4 酶活测定

采用邻联茴香胺-辣根过氧化酶法检测酶活，将酶活检测方法改进如下：

对照组：将邻联茴香胺溶液150 μL和辣根过氧化物酶溶液10 μL混合溶液加入96孔板中，并于25℃保温10 min，然后加入150 μL 5%葡萄糖溶液和30 μL粗酶液，立刻测OD 460。3 组平行实验。

实验组：将邻联茴香胺溶液150 μL和辣根过氧化物酶溶液10 μL混合溶液加入96孔板中，并于 25℃保温10 min；将150 μL粗酶液和750 μL 5%葡萄糖溶液混合均匀后于30℃保温5 min，然后取 180 μL 加入到邻联茴香胺-辣根过氧化物酶混合溶液中，振荡10 s，测OD 460。3 组平行实验。

酶活力单位定义：在上述实验条件下，每分钟催化反应产生1 ng过氧化氢所需要的酶量定义为一个酶活力单位(U/mL)。

酶活计算公式：

Y＝[(A−A 0 )+C]/K×N/T/M

式中：Y—葡萄糖氧化酶活力，U/mL；A：实验组的吸光度；A 0 ：对照组的吸光度；K：标准曲线的斜率；C：标准曲线的截距；N：酶液的总稀释倍数；T：反应时间，min；M：酶液体积，mL。

邻联茴香胺溶液：取7 mg邻联茴香胺用95%的乙醇溶解，转移至容量瓶中用95%乙醇定容至100 mL，保存于4℃冰箱中。

辣根过氧化物酶溶液：取辣根过氧化物酶5 mg用20 mL 无菌水溶解，转移至 50mL容量瓶中定容(使用期限2−3 d)。

5%的葡萄糖溶液：取5 g 葡萄糖用无菌水溶解并定容至100 mL。

1.2.5 酶学性质研究

接种31号菌株于5 mL种子培养基中，25℃、200 r/min培养至 OD 600值为0.55−0.60，然后以1%的接种量转接于100 mL发酵培养基中，25 ℃、200 r/min培养28 h，将发酵液10000 r/min 离心10 min，取上清液进行酶学性质研究。本研究对酶的最适作用温度及温度稳定性、最适作用pH及pH稳定性、不同浓度金属离子和不同浓度化学试剂对酶活的影响进行了研究。

(1)最适作用温度及温度稳定性测定

取150 μL 粗酶液和 750 μL 5%的葡萄糖溶液混合均匀，分别于0、5、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65 ℃水浴5 min；取 150 μL 邻联茴香胺溶液和10 μL辣根过氧化物酶溶液混合溶液加入 96 孔板中，并于25℃保温10 min，然后取180 μL加入到邻联茴香胺-辣根过氧化物酶混合溶液中，振荡10 s，测OD 460；对照组直接加入150 μL 5%葡萄糖溶液和30 μL粗酶液。根据酶在不同温度下的活性绘制曲线，确定酶的最适反应温度。同时将酶液分别置于不同温度(0–65℃)保温1 h，然后在最适反应pH和最适反应温度下检测残余酶活，与未经过处理的酶液进行比较，计算相对活性。设置3组平行实验。

(2)最适作用pH及pH稳定性测定

在最适温度下，pH值为3.0–14.0的50 mmol/L缓冲液(pH 3.0–5.0 磷酸盐-柠檬酸盐，pH 6.0–10.0 Tris–HCl，pH 11.0–14.0 Na₂HPO₄-NaOH)中测定GOD酶活，根据酶在不同pH下的活性绘制曲线，确定酶的最适反应pH值。同时，将酶液分别置于50 mmol/L不同pH的缓冲液(pH 3.0−5.0磷酸盐-柠檬酸盐，pH 6.0−10.0 Tris-HCl，pH 11.0−14.0 Na₂HPO₄-NaOH)中孵育1 h，然后在最适反应pH和最适反应温度下检测残余酶活，与未经过处理的酶液进行比较，计算相对活性。设置3组平行实验。

(3)不同浓度金属离子对GOD酶活的影响

取750 μL 5%的葡萄糖溶液于2 mL离心管中，加入终浓度为1 mmol/L或5 mol/mL含有金属离子(Ni²⁺、Mn²⁺、Ag⁺、Ca²⁺、K⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、Na⁺和Zn²⁺)的试剂，再加入150 μL酶液混合均匀，于30℃下水浴5 min；取150 μL邻联茴香胺溶液和10 μL辣根过氧化物酶混合溶液加入96孔板中，并于25℃保温10 min。然后取180 μL加入到邻联茴香胺-辣根过氧化物酶混合溶液中，振荡10 s，测OD 460。对照组直接加入相应体积的PBS(pH 7.4)。设置3组平行实验。

(4)不同浓度化学试剂对GOD酶活的影响

取750 μL 5%的葡萄糖溶液于2 mL离心管中，加入终浓度为1 mmol/L或5 mmol/L的β-巯基乙醇、尿素、乙二胺四乙酸、曲拉通-100、吐温-80、2,3-丁二酮、Na₂S₂O₄、十二烷基硫酸钠、二硫苏糖醇等化学试剂，再加入 150 μL 酶液混合均匀，于30℃下水浴5 min；取150 μL邻联茴香胺溶液和10 μL辣根过氧化物酶混合溶液加入96孔板中，并于25℃保温10 min。然后取180 μL加入到邻联茴香胺-辣根过氧化物酶混合溶液中，振荡10 s，测OD 460。对照组直接加入相应体积的PBS(pH 7.4)。设置3组平行实验。

1.3 数据处理

使用IBM SPSS Statistics 23软件处理浓度金属离子和化学试剂对GOD酶活的影响的相关数据。

2 结果与分析

2.1 产低温 GOD 菌株的筛选

在筛选培养基上培养48 h后，得到一株产生透明圈并变成紫黑色的菌株，对该菌株进行3区划线纯化。将纯化后得到单菌落接种于发酵培养基上，发酵后进行酶活检测复筛，确定该菌株为产葡萄糖氧化酶菌株，编号为31号。

2.2 形态学鉴定

将31号菌株划线于固体发酵培养基上，25℃培养48 h后观察菌落形态(图1)，单个菌落呈白色，不透明，表面光滑且边缘整齐，中间凸起，易挑取；挑取单菌落染色后进行显微形态观察，该菌株为椭圆状。

图1 菌株 31 号的菌落形态(A)和显微形态(B)

2.3 分子生物学鉴定

将31号菌株的序列提交至GenBank中并上传该序列(GenBank登录号：MZ522112)，在数据库中进行 BLAST 比对，分析表明该菌株与担子菌属(Basidioascus sp.)菌株一致性高达99%，结合形态学鉴定确定31号菌株为担子菌。

图2 31号菌株及相关菌株基于 rDNA ITS 序列通过邻接法构建的系统发育树bootstrap次数设置为 1 000；分支点上的数字表示 bootstrap 的支持率；括号内表示GenBank 登录号；左下角标尺表示 2%的序列进化差异。

2.4 最适作用温度及温度稳定性测定

由图3最适温度曲线可知，该酶的最适反应温度为30℃，酶活力单位达20 U/mL；温度低于或高于30℃时酶活降低；在25−35℃内有较高酶活，达到最适温度下酶活80%以上；50℃时的酶活不足最适温度下酶活的40%；10℃时的酶活高于最适温度下酶活的 25%；在35−65℃内，随着温度的升高酶活快速降低；在0℃时仍有酶活。

图3 葡萄糖氧化酶的最适反应温度

由图4可知，该酶在低于35℃的环境下具有较好的热稳定性，保温1 h处理后酶活保留70%以上；当温度高于35℃时，酶的热稳定性急剧下降，45℃温育1 h后酶活仅剩余10%左右。

图4 葡萄糖氧化酶的温度稳定性相对酶活为100%时的绝对酶活为20.4 U/mL

2.5 最适作用 pH 及 pH 稳定性测定

由图5最适反应pH曲线可知，该葡萄糖氧化酶在pH 7.0的环境下酶活性最高，当pH增大或减小时，酶活下降，但相对于增大pH值来说，降低pH值时，酶活降低的速度更慢，更适合在酸性或偏弱碱性条件下发挥作用。

图5 葡萄糖氧化酶的最适反应pH

由图6可知，该葡萄糖氧化酶在pH 5.0−7.0间较为稳定，剩余酶活力在70%以上；当pH为9.0时，相对酶活力剩余仅为20%左右；当pH大于10.0时，酶液几乎失活，所以该酶适合保存在偏弱酸性的环境中。

图6 葡萄糖氧化酶的pH稳定性相对酶活为100%时的绝对酶活为19.8 U/mL

2.6 不同浓度金属离子对 GOD 酶活的影响

如表1所示，5 mmol/L的Ni²⁺、Na⁺和Zn²⁺对酶活的促进作用尤其显著，浓度为5mmol/L 的Na⁺和Zn²⁺分别提高了约50%和30%的酶活性；5 mmol/L的Mn²⁺对GOD酶活性有显著抑制作用；Cu²⁺、K⁺和Ca²⁺对酶活性有抑制作用，而且浓度越高抑制作用越显著，浓度为5 mmol/L的Cu²⁺几乎使酶活性被完全抑制；当向反应体系中加入Ag⁺时，反应体系内产生白色沉淀，无法检测出酶活，可能是Ag⁺使酶失活。

注：相对酶活为 100%时的绝对酶活为 16.2 U/mL。a、b、c、d 表示显著性差异

2.7 不同浓度化学试剂对 GOD 酶活的影响

由表2结果可知，不同浓度的β-巯基乙醇、乙二胺四乙酸、曲拉通-100、次硫酸钠和二硫苏糖醇对GOD酶活性均有显著抑制作用；浓度为5 mmol/L的乙二胺四乙酸和二硫苏糖醇对酶活性抑制率分别达到78.6%和86.3%；浓度为1 mmol/L的次硫酸钠对酶活性的抑制率达到85%以上，而高浓度的次硫酸钠对酶活性的抑制率不足75%。不同浓度的2,3-丁二酮对酶活性有不同程度的促进作用，高浓度的2,3-丁二酮对酶活性的促进作用大于低浓度。

注：相对酶活为 100%时的绝对酶活为 14.9 U/mL。a、b、c、d 表示显著性差异

3 讨论与结论

在已发表的研究中，石淑钰等从黄海海水中筛选出一株假单胞杆菌(Pseudomonas migulae) GOD2菌株，研究确定其所产葡萄糖氧化酶最适温度为20℃；刘春莹等从大连黄海海域海泥中筛选得到一株酵母菌(WYQ 23)，经过形态学及分子生物学鉴定，确定该菌株为担子菌(Basidioascus sp.)，通过发酵条件优化确定最适温度为25℃，经优化菌株产低温 GOD 酶活力为 1.67 U/mL；胡善松等从大连黄海海域海泥中分离出一株高产 GOD 的细菌，鉴定为柠檬酸杆菌属(Citrobacters sp.)，其最适合温度为15℃，经诱变产GOD酶活力为1.77 U/mL；叶日英等从海泥样品中筛选得到一株产葡萄糖氧化酶的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，该菌在常规LB液体培养条件下葡萄糖氧化酶活力最高为8.8 U/mL，所产酶最适作用温度为14℃，最适pH为7.0；辛国芹等从临沂果园土样中得到一株产葡萄糖氧化酶(GOD)活性较好的菌株，命名为Bla-6，其产GOD酶活为(10.50

±0.25) U/mL。本研究以大连渤海海域海泥为样品，通过平板显色法初筛和酶活复筛，获得一株葡萄糖氧化酶活力达20 U/mL的高产低温31号菌株。与前人筛选的其他菌株相比，该菌株在酶活方面具有显著优势，而且该菌株为低温菌株，在工业生产方面有较好的应用前景。

本研究通过平板培养和简单染色，对31号菌株的菌落形态和显微形态进行了观察，发现其菌落为白色、不透明、表面光滑且边缘整齐、中间凸起、易挑取、显微状态下呈较大的椭圆状。通过分子生物学鉴定确定该菌株为担子菌(Basidioascus sp.)，为研究海洋产低温GOD菌株增加了选择，对GOD资源库的扩充具有重要意义。最适反应温度及温度稳定性结果表明，31号菌株所产GOD酶在 25−35 ℃温度内有较高酶活，最适反应温度为 30 ℃，而且在 0 ℃时仍有酶活，印证了该酶为低温酶。最适反应pH及pH稳定性结果表明，在pH 7.0环境下酶活性最高，在pH 5.0−7.0间活性较为稳定，酶活残余率较高，表明该酶适合保存在偏弱酸性的环境中。不同浓度金属离子及化学试剂对酶活性影响结果显示，5 mmol/L的Ni²⁺、Na⁺和Zn²⁺对酶活的促进作用尤其显著，浓度为5mmol/L 的Na⁺和Zn²⁺分别提高了约50%和30%的酶活性；5 mmol/L的Mn²⁺对GOD酶活性有显著抑制作用；Cu²⁺、K⁺和Ca²⁺对酶活性有抑制作用，而且浓度越高抑制作用越显著，浓度为5 mmol/L的Cu²⁺几乎使酶活性被完全抑制；不同浓度的 β-巯基乙醇、乙二胺四乙酸、曲拉通-100、次硫酸钠和二硫苏糖醇对GOD酶活性均有显著抑制作用；浓度为5 mmol/L的乙二胺四乙酸和二硫苏糖醇对酶活性抑制率分别达到78.6%和86.3%；浓度为 1 mmol/L的次硫酸钠对酶活性的抑制率达到85%以上，而高浓度的次硫酸钠对酶活性的抑制率不足75%。不同浓度的2,3-丁二酮对酶活性有不同程度的促进作用，高浓度的2,3-丁二酮对酶活性的促进作用大于低浓度。