https://blog.csdn.net/m0_72224305/article/details/1271395251写在前面
炙手可热的单细胞测序(scRNA-seq )大家肯定都或多或少听过一些,从今天开始陆续分享我的学习笔记,有不对的地方大家多指正~🤒
在开始前我们先思考几个问题,如下:👇
Q1: 什么是scRNA-seq ,它与bulk RNA-seq 相比如何?
Q2: scRNA-seq 有哪些典型应用?
Q3: scRNA-seq 如何准备样品?
2什么是scRNA-seq?
2.1 什么是bulk RNA-seq
要搞懂什么是scRNA-seq ,我们先了解一下bulk RNA-seq 。 🥳
RNA-seq 用于由细胞混合物组成的样本中,称为bulk RNA-seq ,常用于研究control /diseased 、wild-type /mutant 之间的转录组 差异。
然而,使用bulk RNA-seq ,我们只能估计每个基因在细胞群中的平均表达水平☹️,没有考虑该样本中单个细胞基因表达的异质性。
举个栗子🌰,早期发育研究或大脑等复杂组织。
2.2 scRNA-seq横空出世
为了解决异质性的问题,2009年首次报道了单细胞水平的RNA-seq ,即scRNA-seq ,
与bulk RNA-seq 不同的是,使用scRNA-seq 可以评估每个基因在不同细胞群中的表达水平分布。🤩
成功解决了转录组中细胞特异性变化的问题。可以发现新的或稀有的细胞类型,识别control /diseased 组织之间的差异细胞组成或了解发育过程中的细胞分化。
2.3 scRNA-seq图谱
目前有很多的scRAN-seq 图谱,全面解析了不同物种中的细胞类型 。举几个栗子🌰,如下:
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Human Cell Atlas (H. sapiens)
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Tabula Muris (M. musculus)
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Fly Cell Atlas (D. melanogaster)
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Cell Atlas of Worm (C. elegans)
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Arabidopsis Root Atlas (A. thaliana)
随着技术的进步,scRNA-seq 方法学层出不穷,自首次报道后的技术发展,我们可以看到随着技术的进步,scRNA-seq 可以检测到更多的细胞。
但需要说明一下,不同的技术各有其优缺点,还是老观点,新技术不一定是最好,选适合你的就行了。🧐
3scRNA-seq的样品制备
3.1 经典protocol
通常来说,经典的scRNA-seq 的protocol 可以分为以下几个步骤:
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细胞筛选(基于
表面marker、转基因技术、染色等)。(
可选步骤😊)
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捕获
单个细胞(如
wells ,
oil droplets )。
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处理
raw data 以获得细胞基因的
count矩阵 。
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3.2 制备样品困难怎么办?
在难以分离细胞的组织中或在冷冻组织样本中,可能较难实现单细胞的制备 ,我们可以选择制备单个细胞核 样本。
Note! 但需要注意一下,核RNA 通常含有较高比例的未加工unprocessed RNA, ,会测序到大量含有introns 的转录本。😲
具体的解决方案,我们后面再介绍吧。😘
3.3 常用protocol的对比
这里我们比较一下目前常用的protocol ,这里不包括Smart-seq3 和Smart-seq3xpress ,后面我们单独介绍这两种方法。
4细胞捕获
目前应用最广泛的三种方法为microtitre-plate, microfluidic-array 和 microfluidic-droplet。
各有其优缺点,这里只做简单介绍,感兴趣的小伙伴可以去Google 一下具体差异。
1️⃣ Microtitre-plate
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优点是建库之前可以对细胞进行观察,识别并丢弃
受损的细胞等。
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2️⃣ Microfluidic-array
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优点是通量比
Microtitre-plate通量高,省试剂😂。
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这里提醒大家要注意一下
arrays 的
nanowells 大小问题。
3️⃣ Microfluidic-droplet
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缺点当然也是低成本带来的啦😂,一般
coverage 都比较低,往往检测深度就不够了,
transcripts 比较少。
Tips! 如果用FACS 分离细胞的话,可以染一下live/dead , 避免一些活力低的细胞影响结果。😘
最后祝大家早日不卷!~
点个在看吧各位~ ✐.ɴɪᴄᴇ ᴅᴀʏ 〰
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