| 酶切-连接
| Gateway
| In-Fusion | 方法X？
| 载体形式
| 线性
| 环形
| 线性
| 环形/线性
| 片段形式
| 线性
| 线性BP/ 环形LR | 线性
| 线性
| 最大载体长度
| ~20 kb | ~15 kb
| ~20 kb
| >30 kb
| 最短片段长度
| ~15 bp | ~100 bp
| ~50 bp
| ~150 bp
| 长片段克隆难度
| 极难
| 较易
| 容易 | 极易
| 花费时间
| 长
| 中等
| 短
| 最短
| 无缝克隆
| 否
| 否
| 是
| 是
| 位点自由度
| 低
| 极低
| 高
| 极高
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在深度解析In-Fusion克隆的原理和应用（上）的最后我给自己挖了一个坑：所有无需酶切或PCR扩增载体的同源重组克隆方法（Gateway，Cre/LoxP）都只能发生在特定序列的重组位点；In-Fusion克隆不受重组位点限制可以自由选择同源序列，但是必须要线性化载体。那么，存不存在一种方法X，既不用线性化载体，又可以利用同源重组的原理使得克隆可以发生在载体的任意位置呢？答案是有的，今天就来填这个坑，这个方法就是利用大肠杆菌作为同源重组克隆发生的平台、无需任何克隆试剂、时间花费最短、长片段克隆效率极高、无视载体大小、无视插入片段大小的in vivo recombineering。想要同源重组发生在线性插入片段和环形载体上的任何位置又不线性化载体，那么就不能仅仅利用与In-Fusion一样的核酸外切酶原理，因为核酸外切酶对环形质粒分子无效。但是核酸外切酶消化线性插入片段暴露出来的单链DNA，可以在重组因子的辅助之下，高效地侵入具有同源序列的无损伤双链DNA之中（即环形DNA分子），从而完成同源重组。类似的同源重组过程（双链DNA断裂修复）广泛发生在各种真核和原核生物中，不过在常见的大肠杆菌分子克隆工程菌（DH5α, DH10B, XL10等）中是比较不活跃的。但在表达了来自Rac噬菌体（RecE和RecT）或者λ噬菌体（Redα和Redβ）的重组因子的大肠杆菌菌株中，可以高效地完成这一重组反应。RecE和Redα是5'-3'核酸外切酶，他们的作用和NEBuilder中的T5核酸外切酶一样，消化DNA的5'端，暴露插入片段的3'黏性末端。RecT和Redβ都是重组因子，本质都是单链DNA结合蛋白，在大肠杆菌细胞中稳定单链DNA末端，促进DNA单链向同源双链DNA发生链侵入（如下图所示）。已经商业化的高效重组菌株是GB08-red，针对环形载体克隆优化。另外还有针对线性载体优化的菌种GB05-dir。这两种菌种都比较昂贵（等值大约4500人民币）且难以购买，所以真正在用这个方法的实验室并不是很多。但是这种方法具有极高的克隆自由度，几乎不受载体和插入片段大小的限制，效率很高，操作十分简便，只需要PCR扩增插入片段，并将环形载体和片段一起电转化相应菌种的感受态即可，分子克隆的工作完全交给大肠杆菌去完成。了解这种方法，可以让你在真正遇到克隆难题的时候，有一个非常可靠的备选方案。
 这种方法的常规应用不仅包括In-Fusion试剂盒常见的长片段克隆、定点突变等等，还能够简单粗暴地完成环形载体的直接替换、插入和删除等。需要注意的是，这种直接针对环形质粒的克隆方式会在阳性克隆鉴定方面有一定的挑战性。除非克隆会导致原始质粒的某个抗性丢失，或者获得新的抗生素抗性，否则将无法有效地利用抗生素来进行阳性克隆筛选，很有可能必须通过菌落PCR来鉴定。表达Rec/Red重组酶的菌种不仅能够大幅提高细胞内同源重组克隆的概率，也能够增加质粒内部、质粒-质粒之间和质粒-基因组之间重组的概率，导致质粒的不稳定性。因此GB08-red和GB05-dir菌种都不是持续表达重组酶的，而是将重组酶置于可诱导启动子的下游。只有在需要提高重组率的时候（即转化目的质粒和插入片段时）才添加诱导剂诱导重组因子表达，之后的涂板和质粒提取过程都不添加诱导剂，从而最大程度地提高重组质粒的稳定性。In vivo recombineering有一个非常特殊的情形，就是线性质粒和线性插入片段，这和In-Fusion克隆非常相似，唯一的不同点就是In-Fusion克隆需要在试管内添加重组酶先克隆出具有单链缺刻的产物然后再转化大肠杆菌，而in vivo recombineering直接将准备好的线性质粒和线性片段共转化大肠杆菌即可。有不止一篇文章都声称，将线性质粒、线性片段共转化常规克隆菌种如DH10B，就可以无需克隆试剂在细胞内完成克隆，原理非常接近In-Fusion体外反应的机理，依赖于大肠杆菌核酸外切酶III（XthA）和DNA聚合酶I（PolA），甚至都不需要电转化，化学转化也可以完成克隆。我个人对这些文章持较大的怀疑态度。在没有重组因子的保护下，线性DNA分子在大肠杆菌内非常不稳定很容易被降解，单链之间退火形成重组质粒的效率也不会太高，常规的化学转化对线性片段的转化率也比较低。总的来说，我个人认为这种方法即使可行效率也不会太高。但是既然相关文章在多个杂志都有发表，说明还是有一定可操作性的，非常建议有机会的读者进行尝试，如果成功率比较高可以私信与我分享，然后我会分享给大家，我自己有机会的话也会做一个测试。 
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