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造血干细胞（HSCs）可在移植后重建整个血液和免疫系统，用作多种血液病的治疗性细胞疗法，尽管可以从脐带血中收集，但含量太少，难以成功植入并维持持久的造血重建。人们通常将各种重组细胞因子添加到人类HSCs培养物中以试图促进HSCs的体外扩增，但只支持短期维持。随后，研究人员发现通过添加小分子SR-1和UM171可以实现人HSCs的两周离体扩增，利用这一方法扩增的人脐带血HSCs已经在临床试验中获得喜人结果【1, 2】。2019年，来自东京大学的Satoshi Yamazaki团队和斯坦福大学的Hiromitsu Nakauchi团队合作在Nature发文（详见Bioart报道：专家点评Nature | 日本科学家突破体外扩增造血干细胞瓶颈可靠吗？），他们通过一系列优化实验筛选得到了造血干细胞体外大量扩增的最适条件，该研究成果令不少人激动不已。然而，由于这项工作主要利用小鼠HSCs进行研究，人HSCs的体外扩增效果并不显著，且代替血清白蛋白的高分子化合物聚乙烯醇（PVA）支持HSCs存活并维持其表型的机制尚未解释清楚，因而也有不少权威专家对该工作表示出质疑。近日，Satoshi Yamazaki团队和Hiromitsu Nakauchi团队再度合作在Nature杂志上发文，题为Chemically defined cytokine-free expansion of human haematopoietic stem cells，他们报告了一种允许人类HSCs长期离体扩增的培养系统，以化学激动剂和基于己内酰胺的聚合物完全替代外源性细胞因子和白蛋白，磷酸肌醇3-激酶激活剂与血小板生成素受体激动剂和嘧啶并吲哚衍生物UM171相结合，足以刺激脐带血HSCs的扩增，这一发现将有助于推进HSCs的临床治疗。在之前的工作中，他们通过优化重组干细胞因子（SCF）和血小板生成素（THPO）的浓度，并用PVA代替血清白蛋白以实现功能性小鼠HSCs的长期体外扩增，但这一系统对人HSCs的效果有限（小鼠HSPCs增殖约19倍，而人仅3-4倍）【3】。为了确认人和小鼠HSPCs增殖产生差异的原因，作者分析了与SCF和THPO相关信号通路的磷酸化状态，在人类细胞中观察到PI3K和AKT的显着降低，于是他们着手激活PI3K–AKT信号传导以改善人类HSPCs的扩增。PI3K激活剂740Y-P的添加能明显提高扩增效率，但AKT激动剂SC79无此效果。考虑到之前的工作指出SCF可通过PI3K–AKT–FOXO通路刺激HSCs进入细胞周期，且THPO受体激动剂THPO-RAs可用于诱导人类HSC扩增【4, 5】，作者用740Y-P和THPO-RAs分别取代SCF和THPO。740Y-P和丁酰胺（THPO-RAs的一种）在7天增殖和GEmM CFU（粒-红-巨噬-巨核细胞集落）方面表现出显著改善，最适浓度为740Y-P 1µM和丁酰胺0.1µM，并将两者定义为双激活剂（2a）。需要注意，虽然用2a培养14天细胞总数增加，但以CD41+巨核细胞（MgK）谱系为主。为了解决这个问题，作者添加两种已报道的HSPCs扩增化合物SR-1和UM171，发现UM171(70 nM)、740Y-P(1 μM)和丁酰胺(0.1 μM)的三激活剂(3a)能使HSPCs在30天培养过程中增约14倍，异种移植试验也证明了该体系的体内分化潜能。在确认了基本的人HSCs培养条件后，该团队想进一步提高HSPCs的离体扩增速率，从10种聚合物中筛选出Soluplus（聚乙烯己内酰胺-聚醋酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物，PCL-PVAc-PEG），并通过体外培养和异种移植试验证实了基于PCL-PVAc-PEG的3a培养物支持人类HSCs的稳健扩增，全外显子组测序分析进一步表明培养过程中发生的突变不涉及血液恶性肿瘤等，证明了该培养系统的安全性。图1. 以己内酰胺聚合物为基础的3a培养基支持人造血干细胞在体外高效扩增为了解决HSCs培养物中的细胞异质性，作者对3a条件或其他两种基于细胞因子条件培养的细胞进行scRNA-seq分析，组间差异显而易见，简单来说，3a培养基中能观察到高频率的HSPC-HLF簇和红细胞或MgK祖细胞，而 Mon（单核）和Gra（粒）祖细胞簇通常被耗尽，培养10天的细胞的HLF表达水平高于来自新鲜脐带血的CD34+细胞，提示3a系统更适合LT-HSC（长期造血干细胞）的选择性扩增。最后，该团队想知道3a培养基是否可以支持克隆衍生的HSCs培养物的扩增，将单脐带血来源的CD34+ CD38- CD90+ CD45RA- CD49f+细胞分选到96孔板中培养，7天内，96孔板中有20个孔扩增超过10倍，11个孔扩增超过30倍，将扩增率最高孔内的细胞移植到小鼠中，24周后，10名接受者中有5名表现出强健的外周血、骨髓和脾脏嵌合现象，骨髓和脾脏中多谱系人CD45+嵌合现象超过5%。这些数据表明基于PCL-PVAc-PEG的3a培养基可以支持人HSCs离体的大量扩增和克隆扩增。离体扩增脐带血HSPCs的能力对于解决供体HSCs短缺问题具有重要意义，这项工作报告了一种用于长期（至少30天）扩增人类HSCs的无重组细胞因子且无白蛋白的培养系统，该系统具有化学成分确定的优势，这将改善批次间的差异性，降低试剂成本并促进快速临床转化。总之，该培养系统可能对于对干细胞生物学和HSCs疗法感兴趣的基础科学家和临床医生提供了一个有用的工具。https://www./articles/s41586-023-05739-9 制版人：十一 1. Boitano, A. E. et al. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science 329, 1345–1348 (2010).2. Wilkinson, A. C., Ishida, R., Nakauchi, H. & Yamazaki, S. Long-term ex vivo expansion of mouse hematopoietic stem cells. Nat. Protoc. 15, 628–648 (2020).3. Wilkinson, A. C. et al. Long-term ex vivo haematopoietic-stem-cell expansion allows nonconditioned transplantation. Nature 571, 117–121 (2019).
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