microRNA报告基因实验流程（miRNA靶基因验证）

构建miR-reporter载体（含突变靶位点的荧光素酶报告基因载体）与内参质粒、microRNA　mimics或 microRNA negativecontrol共转染293T或Hela细胞。共转染细胞24-72h后，进行双荧光素酶检测，进一步验确定目的 microRNA的靶基因。

1.microRNA靶点的预测
利用Targetscan,miRanda,PicTar软件得到目的microRNA的预测靶点序列。
2.获得microRNA靶点序列
根据提供的靶序列，合成两条互补的单链DNA模板。或者，设计引物PCR扩增目的microRNA靶基因3’UTR序列，或直接合成。
3.microRNA靶序列克隆
将合成的两条单链退火成双链（具有粘性末端），或将PCR产物双酶切，后连入经过同样双酶切的miR-reporter载体中，连接产物转化大肠杆菌DH5α。
4.阳性克隆鉴定
挑选转化的菌落，PCR筛选含有插入片段的阳性克隆，测序验证克隆的序列和目的microRNA靶序列一致。
5.细胞转染准备
将含目的microRNA靶基因的报告基因载体、内参质粒和microRNA　mimics或microRNA negative control共转染293T或Hela细胞。
6.荧光素酶检测
共转染细胞24-72h后，进行双荧光素酶检测，确定目的microRNA的靶基因。