单细胞 转录组 实验助力高分文章！！！

早！今天小编和大家分析一篇2023年3月发表在《Journal of Translational Medicine》（IF:8.4）期刊上的文章《Multi-omics and experimental analysis unveil theragnostic value and immunological roles of inner membrane mitochondrial protein (IMMT) in breast cancer》。

背景：

乳腺癌（BC）是女性肿瘤中常见的癌症之一，死亡率在所有癌症中位居第四。手术、放疗和内分泌治疗仍然是临床的主要治疗手段，新辅助治疗虽已被广泛应用于高复发和高转移的BC患者，但大多数患者仍旧预后较差，且易复发。越来越多的证据表明，肿瘤细胞能够通过改变线粒体动态来增强增殖和生存能力，因此针对线粒体动态的治疗可能是抑制BC细胞转移能力的有效策略。

线粒体接触点和嵴突组织系统（MICOS）复合物在构建线粒体内膜（IMM）和嵴突连接形成以及影响线粒体动力学和代谢方面起主导作用。IMMT被认为是MICOS的核心，IMMT的下调、修改或破坏均可能导致线粒体功能障碍，最终导致细胞死亡。此外，IMMT是许多癌症的标志物，但IMMT在乳腺癌（BC）的临床病理、肿瘤免疫微环境（TIME）和精准肿瘤学方面的作用仍不清楚。

方法：

1，使用五种方法（WGCNA、SVM-RFE、RF、SLEDAI相关性分析、GEO2R鉴定DEG）筛选SLE的生物标志物；

2，ROC用于分析MX2的诊断价值；

3，clusterProfiler用于GO和KEGG富集分析；GSEA用于途径和生物学过程的变化；ssGSEA用于计算每个样本的通路评分；

4，通过ssGSEA，CIBERSORT，xCell和ImmuCellAI四种算法进行免疫细胞浸润分析；

5，CellMark数据库用来查询中性粒细胞相关标记基因；基于HPA数据库、转录数据和单细胞数据分析免疫细胞中MX2的表达；

6，STRING数据库用来分析MX2的蛋白质互作关系；Cistrome DB数据库用来查找基因的转录因子；DREIMT数据库用于预测SLE的潜在治疗药物。

研究结果：

（一）BC中以IMMT为中心的MICOS成分的临床病理学筛查

首先分析了TCGA数据库中BC样本MICOS亚单位的遗传变异情况（图1A）。1026个BC样本中，有19个（1.85%）显示有单核苷酸变异（SNV）的改变。与CHCHD6（4个样本）、CHCHD3（3个样本）、APOO（3个样本）、APOOL（4个样本）和MICOS10（0个样本）相比，IMMT的SNV数量最高（6个样本）（图1B）；且大多数的SNVs是错义突变（图1B）。在TCGA数据集中，BC肿瘤组织与正常组织相比，IMMT、CHCHD6、CHCHD3、APOO和MICOS10的基因表达水平升高，而与正常组织相比，肿瘤组织中的APOOL水平下降（图1C-H）。随后通过访问CPTAC数据集检查了蛋白质水平的表达，发现除APOO外，IMMT、CHCHD6、CHCHD3和APOOL的蛋白表达与基因表达的趋势相似（图1I-M）。比较不同基因表达之间的不同突变状态，发现IMMT、CHCHD6、CHCHD3、APOO和MICOS10的突变与基因表达无明显关联（图1N）。用对数秩检验来分析基因表达与生存率之间的关联，如图1O所示（所有P<0.05），IMMT高表达与不利的总生存率（OS）和无病生存率（DFS）有关；CHCHD6高表达与不利的OS和无远处转移生存率（DMFS）有关；APOOL和APOO高表达与不利的OS有关；而MICOS10高表达与有利的DMFS和DFS有关。

（二）IMMT在BC中的差异性表达和诊断价值

RNA-seq数据和芯片阵列数据都显示，与正常组织相比，IMMT在BC肿瘤组织中的表达水平有所增加（图2A，B）。RNA-seq数据的特异性随着正常组织的高截止值而增加，而芯片阵列数据无论在哪个截止点都保持了高特异性（图2C，D）。人类蛋白质图谱的免疫组化染色数据证实，与正常组织相比，BC肿瘤组织中IMMT蛋白过度表达（图2E，F）。我们根据GSE11925数据集构建了ROC曲线来评估IMMT对BC的诊断效率。注意到，IMMT的表达水平表现出较高的诊断准确性（AUC：0.701，95% CI 0.65-0.74，P < 0.0001）（图2G）。IMMT的空间转录组学分析显示，IMMT的高水平与BC肿瘤组织的癌变部分同时表达（图2H）。UCSC Xena分析和TCGA-BRCA资源库数据显示，IMMT的表达水平与拷贝数密切相关（图2I，J）。然后我们利用不同的数据库，包括TCGA和瑞典癌症组分析网络-乳腺（SCAN-B），调查了基于各种临床类别的IMMT表达。

所有临床阶段的BC肿瘤的IMMT水平都高于正常组织（图3A）。TCGA资料库的数据表明，所有的BC亚型，包括腔隙型、富含HER2（HER2-E）和三阴性乳腺癌（TNBC）的IMMT水平都有增加，而HER2-E的IMMT水平高于腔隙型（图3B）。同样，SCAN-B资料库的数据表明，所有BC亚型的IMMT都高于正常，而HER2-E的IMMT高于基底样和腔镜A（图3C）。与1级或2级的肿瘤相比，3级的肿瘤显示出IMMT的增加（图3D）。与非TNBC肿瘤相比，TNBC肿瘤的IMMT增加（图3E）。结节状态阳性（N）的IMMT水平比结节状态阴性（N -）高（图3F）。IMMT水平随着诺丁汉预后指数（NPI）评分的升高而增加（图3G）。此外，我们根据Ki67染色水平用IHC检查了IMMT的表达，这是一个独立的BC预后生物标志物。如图3H所示，Ki67高的肿瘤比Ki67低的肿瘤的IMMT水平高。总之，这些结果表明，IMMT的表达可作为一种诊断标志物，而且IMMT与晚期疾病状态有关。

（三）IMMT的预后价值

为了更深入地了解预后，我们研究了IMMT表达与生存率之间的相关性。无复发生存期（RFS）被认为是发生转移的一个适当指标。我们发现BC患者的IMMT高表达与RFS时间减少有关（图4A），IMMT在HER2-E型、管状A型和管状B型中起到了预后指标的作用，但在基底型中没有（图4B-E）。IMMT的高表达表明3级BC患者的RFS时间减少，而在1级和2级中没有发现差异（图4F-H）。在治疗方案方面，IMMT高表达表明接受所有类型的化疗、辅助化疗或他莫西芬的BC患者的RFS时间减少，但新辅助化疗则不然（图4I-L）。此外，IMMT可以作为阴性结节患者预后的独立因素，而不是阳性结节患者预后的独立因素（图4M，N）。由于肿瘤浸润性免疫细胞（TIICs）是TIME不可缺少的部分，并与临床结果有牵连，因此在免疫方面研究了IMMT对BC的预后价值。高IMMT并不表明RFS时间的减少，BC肿瘤中的辅助T细胞1型（Th1）减少，Th2减少，间质干细胞（MSC）富集，巨噬细胞减少，嗜碱性细胞减少，CD4 T细胞减少和B细胞减少（图4O）。高IMMT表明高肿瘤突变负担（TMB）的BC肿瘤的RFS时间减少，但低TMB的肿瘤则没有（图4P）。总的来说，高IMMT对BC患者的预后是不利的，特别是在HER-2E亚型、管腔A和管腔B、肿瘤3级、接受辅助化疗和他莫昔芬治疗以及阴性结节患者。

（四）单细胞水平的分析

接下来在单细胞水平上对IMMT进行定位分析，在多个GEO数据集中基于TISCH的BC单细胞分析证实了IMMT在免疫细胞、恶性细胞和基质细胞中的表达（图5A）。GSE75688的单细胞RNA-seq显示，IMMT主要在肿瘤细胞中表达，尽管在T细胞中相对较低（图5B,C）。BC肿瘤中的有丝分裂的基因特征更为丰富（图5D），其中IMMT是一个关键调节因子。从scTIME门户网站检索的细胞通讯显示了各种T细胞亚群之间复杂的相互作用（图5E）。GSE114724的单细胞RNA-seq显示特定的CD8T细胞群（CD8-GZMK、ZNF683、PDCD1和cycling-T）与IMMT表达之间存在正相关（图5F-H）。

（五）IMMT的过表达与免疫抑制性TIME有关

考虑到TIME在肿瘤生长、扩散和逃避免疫介导的破坏中的重要作用，分析了IMMT与肿瘤-免疫相互作用之间的关联。TISIDB的Spearman相关分析显示，IMMT的表达与BC中大多数肿瘤浸润淋巴细胞呈负相关（图6A），如效应记忆CD8 T细胞（图6B）、CD56bright杀伤细胞（图6C）、自然杀伤细胞（图6D）和自然杀伤T细胞（图6E）。此外，我们观察到IMMT与T细胞抑制因子有正相关，如PD-L1（图6F）、PD-L2（图6G）、IDO1（图6H）和CTLA4（图6I）。使用GEPIA2进行的Pearson相关分析表明，IMMT与效应T细胞特征没有明显的相关性（图6J），而与衰竭T细胞特征（图6K）、静止Treg细胞特征（图6L）和效应Treg细胞特征（图6M）显示出明显的正相关关系。此外，ESTIMATE分析表明，高IMMT的队列表现出基质评分（图6N）、免疫评分（图6O）和ESTIMATE评分（图6P）的降低，同时显示出肿瘤纯度的提高（图6Q）。总之，这些结果表明，IMMT的过度表达与免疫抑制性TIME有关。

（六）IMMT参与细胞周期进展和线粒体抗氧化防御系统

通过Linkedomics分析IMMT的功能富集情况，共有8495个基因与IMMT有明显的正相关，而11660个基因有明显的负相关（图7A），热图直观地显示了前30个单个基因（图7B，C）。基因集富集分析（GSEA）显示，与IMMT共同表达的基因参与了以下Reactome途径的激活：细胞周期、DNA修复、RHO GTP酶效应物、TP53感染性疾病的转录调控和线粒体蛋白导入（图7D）。同时，被抑制的途径包括：GPCR配体结合，蛋白质的O-糖基化，肌肉收缩，和细胞外基质组织（图7D）。同时富集的Reactome途径显示，细胞周期具有最高的归一化富集分数（NES），最多的基因数和最低的错误发现率（FDR）（图7D）。考虑到IMMT对细胞周期活动的主要影响，我们研究了它与癌症进展的关键生物标志物的关系。如图7E-J所示，IMMT水平与癌症增殖相关的生物标志物（KI67、PCNA和MCM2）以及细胞周期的关键调节器（CDK4、CDK2和CDK1）呈正相关。由于IMMT在调节氧化还原状态方面的关键作用，我们调查了它与BC肿瘤样本中线粒体抗氧化功能的关系。IMMT与PGC-1β（图7K）、PRDX1（图7L）、PRDX3（图7M）、HSPA9（图7N）、HSPD1（图7O）和SOD2（图7P）有正相关。这些结果表明，IMMT可能通过调节线粒体的氧化还原状态在BC细胞周期的进展中起作用。

为了验证IMMT在BC中的生物学作用，我们在MDA-MB-231细胞中进行了基于siRNA的敲除（图8A-B）。伤口愈合试验显示，与接受阴性对照siRNA的细胞相比，接受IMMT敲除的细胞迁移能力和存活率下降（图8C-E）。此外，IMMT的敲除导致亚G1期的比例增加，G1期减少，S期增加（图8F，G）。敲除IMMT后，呼吸活动和线粒体膜电位（MMP）降低（图8H-J）。值得注意的是，脂质过氧化的指标4-羟基壬醛（4-HNE）有所增加（图8K，L）。注意到线粒体ROS和一般ROS的增强（图8M，N）。同样，IMMT敲除抑制了MCF-7细胞的迁移能力，并诱发了脂质过氧化。总之，这些结果表明，IMMT在调节线粒体健康和细胞内氧化应激方面发挥了积极作用，这可能是BC细胞的运动能力和增殖能力的原因。

（七）验证IMMT在华裔患者中的临床病理意义，并从泛癌症角度进行验证

为了验证IMMT的临床价值，收集了BC患者（n = 461）的肿瘤组织和临床文件。IHC染色显示，肿瘤组织表达的IMMT水平高于肿瘤毗邻的正常组织（图9A，B），3级肿瘤组织表达的IMMT水平高于2级（图9C，D）。Kaplan-Meier分析显示，IMMT IHC评分高的患者的OS时间减少（图9E）。与观察到的生物信息学结果类似，与低IMMT相比，高IMMT的3级患者的总生存时间更短，即使没有统计学意义。在这方面，我们的临床发现与多组学数据相符。

为了观察IMMT是否具有普适性价值，我们研究了不同癌症及其相应的正常组织的表达情况。我们注意到，多种癌症类型显示出与BC类似的表达模式，包括宫颈鳞癌（CESC）、胆管癌（CHOL）、食道癌（ESCA）、头颈部鳞癌（HNSC）、肝脏肝细胞癌（LIHC）、肺鳞癌（LUSC）、胃腺癌（STAD）和子宫冠状内膜癌（UCEC）（图9F）。高IMMT与CESC（图9G）、LIHC（图9H）、LUSC（图9I）和UCEC（图9J）中较短的RFS时间有明显关联。

（八）药物遗传学分析确定吡多他汀是IMMT高表达的有效药物

为了探索针对BC的潜在有效药物，我们在BC细胞中使用单向导RNA（sgRNA）介导的CRSPR对药物反应和IMMT敲除进行了交叉关联分析。在486种被筛选的药物中，有6种药物被确定为发挥了改变的效力（图10A）。具有高sgIMMT效率的BC细胞系表现出对AICAR的敏感性增加（图10B）。同时，低sgIMMT效率的BC细胞系对MK-1775（图10C）、luminespib（图10D）、ulixertinib（图10E）、camptothecin（图10F）、wee1抑制剂（图10G）和pyridostatin（图10H）的敏感性增加。此外，CCLE数据集证实了吡多素和IMMT表达之间的关系。吡啶斯的敏感性与IMMT表达水平（图10I）和IMMT拷贝数（图10J）呈负相关。分析显示，当细胞表现出高表达的IMMT时，吡多他汀发挥了增效作用，表明它可能是开发精准医疗的可行候选药物。