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摘要: 近年来，由于社会老龄化及肥胖发病率的不断升高，糖尿病患者的数量也逐年上升，然而，约一半以上的糖尿病患者死于糖尿病心血管病并发症。线粒体质量控制与心功能关系密切，高糖可致心肌细胞内线粒体受损而发生心功能障碍，因此，及时有效降解受损线粒体能抑制糖尿病心肌病的发生。线粒体自噬具有清除功能障碍的线粒体、控制线粒体质量、保障细胞内环境稳定的作用。该文通过介绍参与线粒体自噬的蛋白分子及信号通路，对自噬与线粒体自噬在糖尿病心肌病中的作用做一综述。 关键词: 糖尿病心肌病 氧化应激 自噬 线粒体自噬 凋亡 AMPK mTORC1 Parkin PINK1 NIX Research progress of autophagy and mitochondrial autophagy in diabetic cardiomyopathy Abstract: In recent years, due to the aging of society and a rising incidence of obesity rate, the number of diabetic patients is rising year by year. Approximately, more than half of the diabetic patients died from cardiovascular complications of diabetes. Abundant in heart, mitochondria serve as energy resources, so its dysfunction may contribute to myocardial cell damage. Hyperglycemia can cause damage to the inner mitochondria of heart muscle, thus timely and effective degradation of damaged mitochondria reduces the incidence of diabetic cardiomyopathy. Mitophagy can remove dysfunctional mitochondria, control mitochondrial mass and ensure environmental stability in cells. In this review, we summarize the role of autophagy and mitophagy in diabetic cardiomyopathy via introducing some proteins and pathways involved in mitophagy. Key words: diabetic cardiomyopathy oxidative stress autophagy mitophagy apoptosis AMPK mTORC1 Parkin PINK1 NIX 21世纪以来，由于社会老龄化程度不断加重及肥胖率的快速增加，糖尿病的患病率也与日俱增。迄今为止，全世界糖尿病的患病人数大概是4.2亿，推测到2040年，糖尿病患者将达到6.42亿[1]，中国是糖尿病高发国家。糖尿病可引起全身多器官、多系统的损害，约一半以上的糖尿病患者死于糖尿病心血管病并发症，其中糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)的危险因素占首位，可导致患者心力衰竭而死亡。 1 DCM与线粒体损伤DCM是一种不同于高血压性心脏病、冠心病及其他心脏病变的糖尿病并发症。临床上表现为心功能异常，最后演变成心力衰竭、心律失常和心源性休克，严重者猝死。目前，DCM的具体发病机制不明，已有研究表明，糖脂代谢异常、心脏自主神经病变、胰岛素抵抗、肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)激活、氧化应激、心肌纤维化、心肌细胞凋亡、线粒体损伤等均参与DCM的发生发展。 线粒体通过氧化磷酸化为心肌细胞提供能量，线粒体质量控制与心功能关系密切。事实上，在很多糖尿病动物模型中，发现心肌线粒体生物合成和超微结构异常出现受损线粒体[2]。Anderson等[3]在2型糖尿病患者的心房中发现线粒体出现呼吸功能障碍，同时，也有研究者在经链脲佐菌素(streptozocin，STZ)注射与高脂饮食(high fat diet，HFD)建立的糖尿病模型大鼠心肌内，发现线粒体结构紊乱、线粒体顺乌头酸酶活性降低，发生呼吸功能障碍[4]。这些表明糖尿病心肌中线粒体结构及功能出现异常，导致线粒体糖脂代谢紊乱、活性氧(reactive oxygen species，ROS)增加、线粒体分裂增加、线粒体依赖性凋亡途径激活等，引起心肌损伤。因此，及时清除受损线粒体能减少糖尿病心肌损伤。 2 自噬及线粒体自噬2.1 自噬概述自噬是真核生物细胞经溶酶体，清除自身受损细胞器过程的统称，是细胞自我更新、清除受损细胞器的过程。当细胞处于某些环境中，细胞器受损发生功能障碍时，自噬会清除这些细胞组分，维持细胞功能稳态，保障细胞质量控制。 2.2 线粒体自噬概述线粒体作为一种存在于大部分真核生物细胞中的细胞器，能形成ATP给细胞供给能量，与此同时，它也介导细胞凋亡过程。线粒体自噬(mitophagy)即细胞经过自噬程序，并特异选择性地降解受损的或不需要的线粒体。研究者通过酵母和哺乳动物细胞对线粒体自噬进行了大量研究，线粒体自噬主要的调节机制如下： 2.2.1 酵母中的线粒体自噬的调控机制在酵母中，自噬相关蛋白(autophagy related gene, Atg)对自噬的发生影响极大。因此，核心Atg功能的缺陷会影响自噬的发生。2009年，Okamoto等[5]鉴定出的Atg32，被认为是特异性地参与线粒体选择性自噬的因子。细胞在ROS刺激下，Atg32表达明显增加，而Atg32的缺失导致受损线粒体降解被抑制，表明Atg32作为酵母线粒体上一种自噬受体，介导了线粒体的质量控制[5]。 2.2.2 哺乳动物线粒体自噬调控机制2.2.2.1 线粒体的分裂和融合对自噬的影响细胞内线粒体处于线粒体融合和分裂的平衡之中。线粒体分裂对线粒体自噬水平有极大影响，它能使线粒体变小，更易被自噬小泡包裹而降解。线粒体分裂受线粒体分裂蛋白(Fis1)和动力相关蛋白(Drp1)的调控，它们相互作用，促进线粒体的分裂。受损的线粒体部分会在线粒体分裂过程被“切除”出来，形成受损的和健康的两种线粒体部分。健康线粒体在视神经萎缩蛋白1(OPA1)和线粒体融合蛋白1/2(Mfn1/2)作用下，融合到其他健康线粒体上。而被分离出的受损线粒体由于膜电位下降，引起OPA1被蛋白酶水解，以及诱导Mfn1/2被Parkin泛素化经蛋白酶体降解，减少线粒体的融合，有利于受损线粒体的分裂，使自噬形成更容易。所以，线粒体的分裂与融合对线粒体自噬有十分重要的影响。 2.2.2.2 PINKl/Parkin信号通路PINK1/Parkin通路是目前研究比较多的介导线粒体自噬的通路。假定激酶蛋白1(PTEN induced putative kinase 1, PINK1)是一种在胞质中合成的蛋白激酶，它从线粒体膜通道进入线粒体后，被内膜上相关蛋白酶水解。当线粒体受损时，膜电位发生去极化，PINK1水解受到抑制，从而堆积在线粒体外膜上。Parkin是一种胞质的E3连接酶，可以识别受损的线粒体。PINK1招募胞质内的Parkin转至受损的线粒体膜上，因Parkin的E3活性，同时将泛素连接到位于线粒体的底物上，引起膜上蛋白泛素化。发生泛素化的线粒体则可以被接头蛋白P62(一种由自噬作用降解的聚氨酯结合蛋白，其蛋白水平与自噬活性呈负相关)识别，其上带有与微管相关蛋白1轻链3(LC3)相互作用的区域(LIR)，与LC3结合连接到自噬小泡膜上，形成线粒体自噬体，诱导线粒体自噬的发生[6]。 2.2.2.3 线粒体自噬的膜受体NIX和FUNDC1NIX也被称为BNIP3L，与BNIP同源，都是Bcl-2家族促凋亡蛋白成员，参与细胞凋亡的调节过程，还可诱导细胞自噬。NIX上存在LIR，NIX能通过该区直接与LC3/GABARAP作用，招募LC3至自噬体上，引起特异性线粒体自噬的发生。NIX敲除的小鼠红细胞中线粒体清除发生障碍，提示在网织红细胞内，NIX通过参与调控线粒体自噬，清除细胞内部受损线粒体，最终使其形成完全成熟的红细胞，NIX/BNIP3在线粒体自噬中起到关键作用。 FUNDC1是存在于线粒体外膜的蛋白，与NIX、BNIP3类似的是，FUNDC1能直接通过LIR序列和LC3结合来招募自噬体。若LIR序列缺失，FUNDC1将无法参与线粒体自噬的调控。FUNDC1与LC3结合可以介导低氧诱导的线粒体自噬。有研究表明，过表达的FUNDC1使线粒体碎片增加，并伴随线粒体自噬增加，而FUNDC1敲除会减少线粒体的分裂，抑制线粒体自噬发生[7]。因此，FUNDC1不仅能作为线粒体自噬的膜受体，也能通过影响线粒体分裂，增加线粒体碎片来介导线粒体自噬[8]。FUNDC1是能与BNIP3、OPA1相互作用，参与调节线粒体自噬的重要蛋白。 3 自噬、线粒体自噬与DCM的关系随着对自噬研究的展开，线粒体自噬被指出可能是DCM发病的一种机制。然而，目前研究人员对于自噬以及线粒体自噬在DCM中的变化持有不同观点。 3.1 自噬在1型糖尿病中的变化由于胰岛素激活了PI3K/Akt/mTORC1通路，最初认为自噬在1型糖尿病(type 1 diabetes, T1D)和2型糖尿病(type 2 diabetes, T2D)中都会增加。然而，很多研究表明，自噬在T1D动物的心脏中实际上被抑制了[9-10]，并且T1D小鼠模型中，心脏自噬水平减弱很有可能因为哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTORC1)活性增加，或AMP激活的蛋白激酶(adenosine 5'-monophosphate-activated protein kinase, AMPK)活性减少产生的[11-12]。Xie等[11]研究表明，OVE26小鼠和STZ诱导的T1D小鼠心脏自噬程度降低，并且能通过二甲双胍恢复AMPK活性，增强自噬。He等[13]发现，在T1D动物模型中，高糖血症通过增加Bcl-2与Beclin-1之间的相互作用，抑制H9c2心肌细胞的自噬，使小鼠心肌细胞凋亡数量增加，而二甲双胍治疗能减少Bcl-2与Beclin-1结合，具有上调自噬和释放Bcl-2来抑制凋亡的双重作用。二甲双胍通过恢复AMPK活性，增强自噬能力，改善心功能。这些结果表明，自噬减少导致心脏损伤是因为对功能失调的细胞器及蛋白聚集物的清除发生了障碍，而自噬增强可以减少T1D小鼠心脏损伤。同样，Xu等[12]研究发现，STZ小鼠心肌中自噬流减少，表明心肌自噬被抑制，但对于T1D中自噬对糖尿病心肌的影响，Xu有不同观点。他们发现，自噬蛋白Atg16和Beclin-1缺陷型的STZ、OVE26小鼠心脏损伤有所减少，这些小鼠的心脏功能明显提升，氧化应激水平、间质纤维化和细胞凋亡情况都减弱了。相反，心脏特异性的Beclin-1转基因小鼠增强了自噬活性，导致糖尿病引起的心脏凋亡和纤维化。他们认为，自噬水平降低能够抑制T1D模型小鼠的心脏损伤，因此，糖尿病心肌细胞内自噬水平减弱，被看成是一种能够防止细胞被自噬过度降解的适应性反应，避免心肌细胞减少，心功能进一步受损。由于外界环境导致线粒体受损产生大量ROS，此时细胞通过增加自噬水平来清除受损线粒体，防止心肌损伤。适量的增加自噬水平，可以看作是细胞的适应性反应来保护心肌受损。但同时，过度的自噬也会导致正常线粒体受损，使细胞凋亡数量增加，最终导致心肌损伤。因此，机体中自噬发生的“量”是影响DCM的关键因素。适当清除受损线粒体才对糖尿病心肌有最佳的保护作用。 3.2 自噬在T2D中的变化目前就T2D与心肌自噬关系的研究结论还不是非常确定，有研究发现，在HFD诱导的糖尿病模型小鼠心肌中，自噬被抑制[14]；在果糖诱导的胰岛素抵抗和高糖血症心肌中，自噬被激活[15]；也有的研究发现，自噬情况保持不变[16]。Sciarretta等[17]发现，HFD激活了小鼠心脏中的RAS蛋白脑组织同源类似物(recombinant human Ras homolog enriched in brain, RHEB)，导致mTORC1激活，抑制自噬。他们发现在HFD小鼠心肌中，LC3Ⅱ水平降低，P62升高。用溶酶体融合抑制剂氯喹处理后，HFD小鼠心脏中GFP-LC3的荧光阳性细胞的数量没有增加，表明其未能形成自噬体。相对的，当Xu等[18]在胰岛素抵抗和代谢综合征的背景下观察自噬流时，发现HFD小鼠心脏功能受损，并将LC3Ⅱ堆积在心脏中，提示自噬体的数量增加了。他们还指出，P62的积累表明自噬体降解受阻。通过透射电子显微镜，在HFD小鼠的心脏中观察到自噬体的累积，自噬溶酶体缺乏。此外，HFD小鼠用氯喹处理后，没有积累额外的LC3Ⅱ，而控制饮食的小鼠却有此现象，证明HFD导致小鼠心脏组织中自噬体清除发生障碍。因此，Sciarretta等[17]认为，在HFD小鼠的心脏中，自噬体的形成被抑制，Xu等[18]指出自噬体降解受阻。综上所述, 这些研究表明T2D小鼠心脏自噬流受损。但最近Munasinghe等[19]发现，T2D通过Beclin-1通路，增加患者心肌内自噬。他们通过冠状动脉搭桥手术收集糖尿病患者与非糖尿病患者的左心耳，并进行免疫荧光与Western blot分析，观察到LC3B-Ⅱ和Beclin-1表达增加，而P62表达减少。电镜观察到糖尿病心肌中自噬体增加，同时，他们给患者注射氯喹后，在体内检测自噬流，发现糖尿病心肌中LC3B-Ⅱ水平增加，证明T2D心肌中自噬活性增加。而高糖培养的Beclin-1缺陷型小鼠心肌内，自噬水平被抑制，说明糖尿病通过Beclin-1通路来增加自噬水平。自噬研究中，LC3B及P62的表达水平常被用作检验自噬情况的标准。然而，自噬是一个动态过程，仅仅评价LC3Ⅱ的表达或自噬体数量不能代表整个自噬过程，只有基于自噬流的研究结果才更为可靠，未来还需要更多研究阐明。 HFD糖尿病小鼠的心肌内，自噬增强似乎是一种保护性的反应，可以减少心脏损伤。例如，在HFD小鼠心脏中持续激活RHEB和mTORC1，会导致自噬抑制，加剧了心肌梗死后缺血性损伤，而HFD小鼠心肌在mTOR缺陷和雷帕霉素(mTORC1的强效抑制剂，也是自噬的诱导剂)处理恢复自噬后，HFD心肌损伤减少[17]，提示T2D中自噬减少导致心脏损伤。由PRAS40(蛋白激酶B的作用底物，亦是mTORC1的特异性结合蛋白)介导引起mTORC抑制，能降低HFD诱导的DCM的发生率，雷帕霉素处理后，db/db2型糖尿病小鼠的心脏功能加强[20]。这些研究证明，在T2D小鼠心肌中，自噬水平增加能减少心脏损伤。 3.3 糖尿病心肌中自噬与线粒体自噬自噬活性不能表示非标准自噬的状态。有研究发现，在小鼠注射STZ后的3周，自噬水平减少，而线粒体自噬到后期才减少，并且Beclin-1或Atg16缺陷型糖尿病小鼠心肌恢复了PINK1、Parkin和溶酶体相关膜蛋白1(lysosome-associated membrane protein1, LAMP1)的表达和线粒体定位，Rab9(一种与非标准自噬有关的小GTP结合蛋白，当缺乏Atg5时，在红细胞成熟过程中负责线粒体降解)线粒体表达也增加，并且在线粒体中Rab9蛋白含量增加更为明显[12]，说明Rab9可能被转移到线粒体中，介导线粒体在糖尿病心脏中的降解。这些结果表明，恢复的线粒体自噬可能减轻自噬缺陷糖尿病小鼠心肌损伤，当标准自噬被抑制，选择性自噬上调，在糖尿病早期这可能会促使线粒体自噬增加，保护糖尿病心脏。 线粒体自噬能维持心肌细胞内稳态，在心脏中起重要作用。目前，对PINK1/Parkin介导的线粒体自噬研究较多，多项研究已经证明，PINK1和Parkin蛋白水平在糖尿病动物组织，包括心脏中都是减少的[21]。Scheele等[22]发现，PINK1在T2D病人骨骼肌中被抑制。Xu等[12]研究发现，在T1D心肌中自噬水平减少，PINK1和Parkin水平也明显减少，高血糖抑制线粒体自噬，导致受损线粒体堆积，使细胞凋亡[23]。在Parkin缺陷的心脏中，线粒体自噬被抑制，导致受损线粒体堆积，细胞死亡，说明PINK/Parkin介导的线粒体自噬障碍会导致心脏损伤[24]。高蓓蕾等[25]发现，高糖会抑制SD大鼠原代心肌细胞自噬水平，导致线粒体功能发生障碍，而Drp1、Parkin蛋白通过增加线粒体自噬水平，改善线粒体功能，减少心肌细胞凋亡。以上表明糖尿病心肌中线粒体自噬减少使心肌受损，而线粒体自噬增加能抑制糖尿病心肌损伤，其中的作用机制尚不清楚。可以猜测在糖尿病心肌中，前期自噬水平降低引起线粒体自噬上调，对心肌起到保护作用，到DCM后期，线粒体清除能力下降，造成受损线粒体堆积，导致心肌受损。 4 小结在T1D和T2D中，自噬情况有很大差异。T1D小鼠模型中，心脏自噬水平被抑制很可能是由于mTORC1活性增加或AMPK活性减少产生的，大量受损线粒体无法被清除而累积在心肌，最终导致心功能障碍。而在T2D中，自噬水平的变化是非定性的，说明T2D中，线粒体的自噬水平是非常复杂的。自噬的状态也不完全反映线粒体自噬的状态。作为一种选择性自噬，线粒体自噬在心脏中有重要作用，目前少量研究表明，糖尿病心肌中PINK1/Parkin、Drp1介导的线粒体自噬减少，导致心肌损伤，这能为DCM防治提供新思路，但还需要更多的实验来对该研究领域作进一步的阐述，这会成为未来几年对DCM的研究热点，也许还会成为治疗DCM的新入手点。 参考文献
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