【原】癌症的单细胞表观遗传学

健明 2023-04-19 发布于广东

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文章信息

题目：Single cell cancer epigenetics
日期：2022-10
期刊：Trends in Cancer
链接：https://www./science/article/pii/S2405803322001339

我们需要单细胞表观遗传学方法来揭示肿瘤异质性

尽管目前我们发现癌细胞可能由驱动致癌作用的基因突变引起，但许多肿瘤相关的问题还是不能单独依靠遗传因素来解释，例如肿瘤进展、治疗过程中的耐药和转移，这里面的非遗传因素其实也具有至关重要的作用。

在不改变DNA序列的情况下，基因表达的调节机制主要有五类：

(i) DNA甲基化：可以通过全基因组亚硫酸氢盐测序 (WGBS)、简化代表性亚硫酸氢盐测序 (RRBS) 或 450k/850k Illumina 甲基化芯片
(ii) 染色质可及性：利用转座酶可及染色质测序法 (ATAC-seq) 进行研究
(iii)组蛋白修饰和(iv) DNA-蛋白质相互作用：可以用染色质免疫沉淀测序 (ChIP-seq)进行研究
(v) 染色质立体结构：染色体构象捕获来探索染色质 3D 结构技术，例如 3C、4C、5C、Hi-C、启动子捕获 Hi-C 和 ChIA-PET

以上这些技术的一个共同缺点就是需要相当大的细胞样本量，至少需要几千甚至数百万个细胞，最后我们也只是获得了一个平均值。

而肿瘤是一个高度异质性的实体，包含恶性和非恶性细胞，每种类型的细胞在癌症进展中都非常重要。有6个方面的问题是不能简单通过组织层面的方法去解决的：

（i）克隆异质性：肿瘤可以包含多个恶性亚克隆，每个亚克隆都具有独特的遗传和表观遗传特性。随着癌症群体的进化，细胞会积累遗传和表观遗传改变，从而导致新克隆的出现，这些新克隆可能具有新的选择性优势（例如，增强的增殖、对治疗的抗性、侵袭性等）。单细胞方法能够检测其中的每一个克隆中（尤其是较小的、难以检测的亚克隆），从而揭示有价值的预后信息。
(ii) 肿瘤微环境（TME）：肿瘤不仅仅包含恶性细胞，还包含无数类型的非恶性细胞，它们在癌症进展中具有不同的作用。
在许多癌症类型中，T 细胞含量与肿瘤进展直接相关，其中细胞毒性 T 细胞(Tc) 和辅助性 T 细胞（Th1、Th2 和 Th17）与良好预后相关。
肿瘤相关巨噬细胞在癌症进展中起着至关重要的作用，这取决于它们的 M1/M2 分化状态。此外，自然杀伤 (NK) 细胞、B 细胞、内皮细胞、成纤维细胞和其他细胞类型参与了这个复杂的相互作用。
(iii) 空间组织和细胞间通讯：恶性和非恶性细胞并非随机分布在肿瘤内，而是占据肿瘤空间的特定位置，产生影响疾病进展的细胞-细胞相互作用。因此了解每个细胞的空间分布对于评估某些类型肿瘤（例如黑色素瘤）的“热度”至关重要，其中细胞毒性 T 细胞的相对数量和位置也是癌症进展的关键决定因素。
(iv) 分化和发育过程
(v) 转移：一些癌细胞获得了离开原发部位并在远处组织定植的能力，这是大多数癌症死亡的原因。从转化到在新组织上定植，转移性癌细胞会经历巨大的变化，例如获得更高的动力（上皮-间质转化）、避免免疫细胞监视以及适应新的次要生长部位
(vi) 新的治疗耐药机制的出现：某些恶性亚克隆由于丰度低而无法通过组织层面的方法检测到，但它们可能含有关键突变和表观突变，使它们对治疗产生抗性，这些耐药亚克隆最有可能在一线治疗后成为主要亚克隆。

所以，单细胞水平上对不同表观遗传特征进行分类，出现了许多研究方法。

单细胞表观组单组学技术

DNA甲基化

5-甲基胞嘧啶 (5mC) 是最著名的DNA 修饰。在哺乳动物中，这种甲基化主要发生在胞嘧啶中，随后是鸟嘌呤，形成 5'-to-3' CpG 对。大约 70% 的人类基因启动子富含多个成群的 CpG 对，形成易于发生 5mC 甲基化的“CpG 岛”。

在这些区域中，甲基化充当抑制开关，限制基因表达。此外，5mC 还存在于其他基因组区域，例如基因体和远距离调控区域（增强子和CTCF位点），顺式调节它们的功能。在大多数类型的癌症中，DNA 甲基化显著失调。肿瘤抑制基因/癌基因中的启动子高甲基化/低甲基化是肿瘤进展的公认驱动因素。此外，增强子甲基化和其他远距离调控区域的失调可能通过促进肿瘤表观遗传异质性对癌症产生重要影响。

基于组织的方法是利用亚硫酸氢盐处理DNA后，未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，然后就可以检测甲基化胞嘧啶。之后在2013 年，开发了第一个基于亚硫酸氢盐的测序方法来检测单细胞水平的 DNA 甲基化，即single cell-reduced representation bisulfite sequencing (scRRBS)。之后开发的post-bisulfite adaptor tagging (PBAT) 技术将CpG的覆盖度从原来的 3–5%增加到18%（测序饱和情况下能到48%），于是新的单细胞技术也应运而生：scBS-Seq、scWGBS、scPBAT。

染色质可及性

全基因组 DNA 可及性能够识别参与抑制或激活基因表达的 DNA 调控元件 (RE)，例如基因启动子和增强子。这些非编码区域与了解癌症生物学和确定控制肿瘤发生的途径有关。最常用技术是单细胞 ATAC-seq，或者替代的sciATAC-seq。例如，基底细胞癌中 TME 的 scATAC-seq 有助于表征免疫、基质中的调节网络和恶性细胞，帮助识别与肿瘤浸润淋巴细胞中 T 细胞耗竭相关的调节机制。

scATAC-seq 还有助于了解癌症治疗反应的变化。例如，对接受单独化疗或与检查点抑制剂联合治疗的TNBC患者染色质可及性和免疫细胞转录组的分析表明，高水平的CXCL13⁺ T 细胞在对联合治疗的有效反应中具有关键作用。scATAC-seq 还揭示了 TNBC 和肺癌治疗后的合成致死率和表观遗传耐药机制。

染色质可及性也与区分成熟和干细胞群体有关，是后者在许多癌症中的关键决定因素。最近的一项研究利用scATAC-seq 发现原发性胶质母细胞瘤起始细胞是异质的，并且包含了与生存相关的三种不同状态，这些状态由独特的转录因子 (TF) 控制。

组蛋白修饰和 DNA-蛋白质相互作用

组蛋白经过一系列的翻译后修饰，这会导致转录过程中染色质状态的开放或抑制。在单细胞分辨率下解释这些组蛋白标记，有助于发现癌细胞内的调节机制异质性，从而能够检测可能与耐药性和复发相关的罕见染色质状态。

scChIP-seq可以探索基因组内的组蛋白标记、转录因子和其他 DNA 相互作用蛋白；同样，单细胞染色质免疫切割测序 (scChIC-seq) 也是一种以单细胞分辨率分析组蛋白修饰的方法。它通过 MNase 与靶向感兴趣的组蛋白修饰的特异性抗体的结合，周围的 DNA 被切割成小部分，然后进行测序。

染色质 3D 结构

基因组的 3D 结构受染色体构象和细胞核内折叠的控制，在基因表达的调控中具有重要作用，例如，促进调节特定基因表达的增强子和启动子的相互作用。在某些癌症中，这种基因组结构由于基因组重排或结构变异而被破坏，从而影响癌细胞的调控。

单细胞表观组多组学技术

Single-cell Nucleosome Occupancy and Methylome sequencing (NOME)-seq技术可以分析每个细胞的染色质可及性和 DNA 甲基化状态。此外，还可以使用 scMethyl- HiC和 sn-m3C-seq 等工具同时分析单个细胞中的染色质 3D 结构和甲基化组。

single-cell Chromatin Overall Omic-scale Landscape Sequencing (scCOOL-seq) 可以通过探索核小体定位来提供更深入的表观基因组特征、染色质可及性、DNA 甲基化、拷贝数改变 (CNA)。例如，scCOOL-seq + scRNA-seq鉴定了两种新的预后胰腺导管腺癌生物标志物（ZNF667 和 ZNF667-AS1）。另一个多组学方案是 scTrio-seq，它可以探索了单细胞 DNA 甲基化组、转录组和 CNA。

空间表观基因组学

基于 RNA、DNA、多重荧光和同位素标记的空间技术现在可以探索保留空间信息的组织的细胞类型组成。结合空间背景有助于研究多种肿瘤的结构，以及了解恶性和非恶性细胞（例如基质细胞和免疫细胞）如何在 TME 中分布。

例如，空间 CUT&Tag可以对小鼠胚胎组织切片的不同组蛋白修饰进行全基因组映射，帮助定位不同细胞类型的空间位置。此外还有Epigenomic MERFISH技术、Single cell combinatorial indexing on Microbiopsies Assigned to Positions for the Assay for Transposase Accessible Chromatin (sciMAP-ATAC) 技术