【综述】糖尿病足溃疡慢性伤口的形成机制及新型敷料的研究进展

文章来源：中华糖尿病杂志, 2023,15(2) : 199-203

作者：陈耀楠 王丹钰 袁倩 袁慧娟

单位：河南大学人民医院　河南省人民医院内分泌科

摘要

糖尿病足溃疡常迟延愈合，形成慢性伤口，生物膜相关感染难以有效控制，逐步导致截肢等不良结局，是糖尿病患者致残、致死的主要原因。传统抗菌、清创、负压吸引等治疗方式存在不足，生物材料科学的发展为糖尿病足溃疡提供了新的治疗思路。该文就糖尿病足溃疡慢性伤口的形成机制、生物膜的附着及新型敷料的研究进展进行综述。

国际糖尿病联盟调查显示，2021年全球20~79岁人群糖尿病患病率约为10.5%（5.366亿人），预计2045年上升至12.2%（7.832亿人）^［1］。糖尿病足溃疡（diabetic foot ulcer，DFU）是糖尿病的严重慢性并发症，是糖尿病患者致残、致死的主要原因，给社会带来沉重负担^［2］。DFU伤口迟延愈合，易受金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌等病原菌感染^［3］，可形成生物膜并附着于伤口内，导致感染慢性化，目前临床对存在感染、坏死的DFU创口多采用清创术清除坏死组织，联合降糖、抗菌、负压引流、传统敷料等治疗。但部分患者病情反复，可能与传统治疗在清除生物膜、促进伤口愈合方面效能低有关。且近期由于新型冠状病毒感染疫情，部分患者为降低新型冠状病毒感染风险而减少就医频次，导致病情进展，生物材料科学的发展有望使这些DFU患者得到便捷有效的处理。本文就DFU慢性伤口的形成机制、生物膜附着以及用于治疗DFU创面的新型敷料进行介绍。

一、DFU的流行病学及发病机制

DFU在全球糖尿病患者中的发病率为19%~30%^［4］，其主要危险因素是高龄、男性、2型糖尿病、低体重指数、较长的糖尿病病程、高血压、糖尿病视网膜病变和吸烟史^［5］，患者每年死亡率高达11%；每20秒钟就有一位糖尿病患者因DFU截肢，截肢患者死亡率更高达22%^［2］，平均每位患者每年DFU相关的医疗支出超过8 000美元，是没有足部溃疡患者的5倍^［4］。无法衡量的无形成本也对患者的生活产生重大影响，包括焦虑、沮丧、不适、疼痛、失去独立性以及其他一些低生活质量而产生的成本^［6］。

DFU发病机制复杂，是多因素共同作用的结果，其中糖尿病周围神经病变（diabetic peripheral neuropathy，DPN）和糖尿病周围血管病变（peripheral artery disease，PAD）起主要作用^［7］。糖尿病高糖毒性引起多元醇旁路活性增加，干扰神经组织代谢，引起DPN，对足部的影响包括：（1）外周运动神经病变带来足部畸形，致使足部生物力学异常；（2）感觉神经病变使患者失去保护性感觉；（3）自主神经病变使患者足部出汗减少，导致皮肤干燥、皲裂^［4］。上述因素导致足部产生异常生物力学负荷，在承受垂直或剪切应力的区域产生高机械应力，皮肤增厚形成胼胝，此时患者足部遭受外伤或伴发PAD可导致皮肤溃疡^［7］。糖尿病患者血脂代谢异常，同时C反应蛋白、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等炎症因子增加，导致血管内皮细胞功能障碍，促进动脉斑块形成导致PAD，造成血运障碍，阻碍氧气、免疫细胞、抗菌药物的运输，参与DFU的进展并影响伤口愈合^［8］。

二、DFU慢性伤口的形成机制

皮肤伤口愈合是一个高度协调的过程，包括3个重叠的阶段：（1）炎症，包括止血、炎症细胞募集以及细胞因子和生长因子的分泌；（2）增殖，其特征在于肉芽组织形成；（3）重塑，肉芽组织被重组并形成成熟的疤痕^［9］。慢性伤口在临床上一般指治疗1个月后仍未愈合，也没有愈合趋势的伤口^［10］。DFU伤口炎症期延长、增殖期缩短和不规则重塑^［7］，形成高炎症水平、高氧化应激水平和低氧的伤口环境，这些因素共同导致迟延愈合，形成慢性伤口^［11］。

1.炎症期延长：嗜中性粒细胞和巨噬细胞滞留在伤口床中，形成富含炎症因子（如IL-1β、IL-6和TNF-α）和活性氧（reactive oxygen species，ROS）的环境，损害组织并阻止成纤维细胞和角质形成细胞的增殖，巨噬细胞吞噬能力降低，使得细菌和碎片积聚并降低血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等生长因子的表达，限制了血管生成和进展到增殖阶段^［12］。

2.肉芽组织形成受损：肉芽组织包括由成纤维细胞产生的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）和侵入内皮细胞形成的新血管。糖尿病患者体内一氧化氮、生长因子水平降低导致细胞增殖及功能障碍，基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）的高表达会引发ECM的过度降解；此外，高血糖水平以及糖尿病伤口中积累的晚期糖基化终末产物导致细胞内的转录因子如缺氧诱导因子-1、叉头状转录因子O1、Nrf2等水平下降，使糖尿病伤口血管生成延缓，肉芽组织含量减少，影响组织修复并导致延迟愈合^［13］。

3.重塑受阻：糖尿病患者伤口中ROS的异常增加，引发氧化应激水平升高，导致角质形成，细胞死亡和迁移受损，从而导致异常的表皮迁移和不完全的伤口闭合，这会随着ECM的重塑和降解而进一步恶化；伤口中蛋白水解环境异常，ECM蛋白的过度分解和异常蛋白-蛋白键的形成会破坏成熟胶原基质的正常形成^［9］。

溃疡部位再生组织的代谢活跃，对氧气的需求及利用增加，但由于血管生成受损，氧气的供需失衡，最终在伤口附近形成具有高氧化应激的低氧环境及持续性的炎症，导致伤口迟延愈合并形成慢性伤口。

三、DFU伤口中的生物膜

1.生物膜的形成：皮肤是重要的物理屏障，表面存在大量微生物，天然皮肤菌群通过与病原菌竞争并抑制其发育、分解皮肤代谢物（如脂质）和调节免疫系统来保护身体^［14］。DFU伤口慢性化，是病原菌的良好温床，逐渐被细菌定植并发展为感染，DFU伤口中最常见的细菌有金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌^［3］。细菌将自身包埋在自产的细胞外聚合物（extracellular polymeric substance，EPS）中，称为生物膜，目前认为生物膜形成过程包括^［15］：（1）细菌通过与皮肤间的静电吸引及细菌附属器（如鞭毛、菌毛）可逆地吸附于生物或非生物表面；（2）细菌增加鞭毛的数量及长度介导不可逆粘附并分泌EPS基质；（3）细菌增殖聚集为微菌落，形成3D结构并通过群体感应（quorum sensing，QS）进行细胞间通讯；（4）生物膜成熟，达到由QS调节的最佳细胞密度并形成蘑菇状结构。约60%的慢性伤口存在生物膜，这个比例在DFU患者中可能更高。一项纳入了65例DFU患者的横断面研究表明，所有DFU慢性伤口中均可检测到生物膜的存在，二代测序结果显示，DFU生物膜中最丰富的菌属是葡萄球菌属、棒状杆菌属、无乳链球菌、厌氧球菌属、假单胞菌属和普雷沃菌属^［16］。

2.生物膜的特性：与浮游细菌相比，生物膜具有明显的特征。生物膜与细胞外环境相互作用，形成聚集体和屏障，其固有的代谢活动而产生酸性环境，一定程度上使抗生素失效，产生逃避免疫系统攻击并诱导炎症反应的抗原^［17］；带负电荷的生物膜限制带正电的抗生素通过生物膜，导致抗生素对生物膜的渗透不良，对抗菌剂的耐受性是浮游细胞的1 000倍^［18］。同时，QS还改变生物膜中细菌细胞的表型，使生物膜内部的细菌多处于静止状态，进而逃避免疫系统的攻击，大部分抗生素仅对代谢活跃的细菌有效，这也是生物膜耐受性大幅增强的原因^［19］。

3.生物膜的检测：生物膜感染的伤口表面通常存在有光泽、半透明的黏液层，是一种移除后可迅速恢复的凝胶状物质，这有助于临床医师对生物膜定位^［16］，主要的检测方法有形态学分析和分子检测技术。（1）形态学分析：组织活检后常规染色（如HE染色、革兰染色）和光镜检查是检测生物膜的有效手段，可观察到微生物和白细胞聚集体被包裹在自产基质中并嵌入软组织^［20］，但某些细菌染色不典型或不着色，有一定局限性。（2）分子检测技术：荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）通过荧光标记寡核苷酸与细菌的特定核糖体RNA结合，使用FISH和共聚焦激光扫描显微镜可对生物膜进行可视化和量化分析，此类方法多用于科研，在临床实践中未常规执行^［21］。创面印记技术通过硝酸纤维素膜收集伤口表面生物膜成分，进行差异染色，可识别生物膜感染伤口，是一种无创、精确的评估方法^［22］。

伤口的迟延愈合导致DFU感染机会增加，细菌在各种环境信号影响下形成生物膜，传统抗菌治疗对生物膜相关的感染效果欠佳，这会进一步导致伤口愈合过程受损，形成恶性循环。

四、用于治疗DFU的新型敷料

DFU伤口的低氧高应激环境及生物膜附着，使伤口慢性化及感染难以控制。清创术可有效清除坏死组织，部分患者术后仍有愈合不佳或溃疡反复，可能与上述原因密切相关。开发新型敷料，促进DFU伤口的恢复是研究的热点，新兴敷料如蔗糖八硫酸盐敷料已被推荐至临床使用。以生物材料科学为基础的新型材料层出不穷（表1），主要策略是以壳聚糖、透明质酸、纤维素、聚乙烯醇或其他生物相容性良好的高分子聚合材料为载体，负载传统抗生素、金属离子、纳米粒子（nanoparticles，NP）、生长因子等物质，制备具有一种或多种功能的新型敷料，成为一个持续或响应性的高效药物输送系统，具有良好的应用前景。

1.供氧敷料：DFU伤口中低氧环境影响伤口愈合，氧气调节细胞增殖、迁移和新血管形成对伤口愈合至关重要。目前临床上有高压氧和局部气态氧治疗，主要采用气态氧输送，在穿透皮肤方面效果不佳，Chen等^［23］设计了含有微藻的水凝胶珠，并添加碳酸盐为碳源，通过呼吸和光合作用产生局部溶解氧，其溶解氧输送效率比局部气态氧穿透皮肤的效率高100倍，大幅加速了糖尿病小鼠的慢性伤口表型向急性伤口转变，并促进皮瓣生成。Zehra等^［24］以具有生物相容性的疏水性聚合物聚己内酯为载体，负载过碳酸钠，制作了电纺纳米纤维伤口敷料，过碳酸钠在伤口附近缓慢分解并释放氧气，使缺氧诱导因子-1α基因的表达显著增加，在糖尿病大鼠慢性伤口模型中原位氧释放改善愈合皮肤组织中表皮和真皮的再上皮化和结构，促进伤口愈合。

2.促血管化敷料：DFU中血管生成受阻，影响氧气、白细胞、抗菌药物运输是伤口慢性化的重要原因。影响血管生成的细胞因子主要有VEGF、血管生成素、成纤维细胞生长因子^［25］。氧化锌纳米颗粒（ZnO-NP）通过丝裂原活化蛋白激酶/蛋白激酶B/内皮型一氧化氮合酶途径产生一氧化氮来诱导内皮细胞迁移并增强血管形成^［26］，在敷料中加入ZnO-NP是有广泛前景的方法。Augustin等^［27］制造了聚己内酯/ZnO-NP电纺膜，促进真皮成纤维细胞增殖，增加成纤维细胞生长因子2和VEGF-A表达，加速血管再生，促进伤口愈合。

3.抗氧化敷料：在生理水平上，ROS调节细胞增殖、凋亡和体内氧化还原反应平衡，辅助免疫系统攻击和杀死细菌，然而，DFU中ROS的过量产生引起氧化应激，通过触发诸如坏死、炎症和纤维化疤痕等有害过程，延缓皮肤伤口愈合或受损组织再生^［28］。虾青素（astaxanthin，ASTA）是一种强抗氧化剂，水溶性和稳定性低，应用受到限制，Oh等^［29］用卵磷脂纳米脂质溶胶（Lec NS）作为载体制作了高负载量ASTA纳米脂质体（ASTA@Lec NS），具有良好的生物相容性及非常高的抗氧化活性，可使细胞培养环境中的ROS水平降至接近正常水平，并促进人真皮成纤维细胞中胶原蛋白的生成和抑制MMP-1和MMP-3的表达，对皮肤伤口愈合具有积极作用。Thi等^［28］将抗氧化剂没食子酸共轭明胶（gallic acid-conjugated gelatin，GGA）负载至明胶-羟苯基丙酸（gelatin-hydroxyphenylpropionic，GH）水凝胶中，制造出可注射新型水凝胶GH/GGA，具有自由基清除性能，高机械强度和生物降解性，GH/GGA水凝胶在体外显著抑制ROS对人真皮成纤维细胞的氧化损伤，在全层皮肤缺损糖尿病小鼠模型中有效地消耗了ROS，促进毛囊形成、新生血管形成，并促进再生的胶原纤维高度有序排列。

4.抗生物膜敷料：硫化氢（hydrogen sulfide，H₂S）作为继一氧化碳和一氧化氮之后的第3种生物气体递质，可能通过激活ATP敏感钾通道增加中性粒细胞迁移来清除细菌感染和加速恢复过程，具有破坏生物膜、调节炎症反应、促进血管生成等多种效应。Zhang等^［30］受气体分子介导疗法启发，以硫化锌（Zinc sulfide，ZnS）作为H₂S产生剂和吲哚菁绿（indocyanine green，ICG）作为光敏剂制备了纳米灭菌剂ICG-ZnS NP，在近红外激光照射下释放Zn²⁺和H₂S，体外实验破坏耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）生物膜，抑制炎症因子分泌；在伤口MRSA感染的小鼠模型中，Zn²⁺、H₂S的释放及红外线热疗使伤口生物膜得到有效消除，MASA感染得到有效控制，TNF-α和IL-6的分泌量显著减少，伤口处胶原蛋白沉积和新血管形成加速。

5.抗生物膜化合物：一些化合物已被证实可抑制生物膜，但少有在敷料中应用的报道。生物膜降解剂主要针对EPS，如脱氧核糖核酸酶Ⅰ、淀粉酶、分散素B、溶葡萄球菌酶和藻酸盐裂解酶，都有降解EPS的作用^［31］。大蒜中分离的阿交烯（Ajoene），辣根中分离的异硫氰酸酯Iberin是生物膜群体感应抑制剂^{［32, 33］}。抗菌肽由微生物产生，尺寸小，带正电荷，可被吸引向带负电荷的生物膜表面，可能通过干扰细胞膜起抗生物膜作用^［34］。基于鸟嘌呤核苷酸的第二信使ppGpp和pppGpp［统称（p）ppGpp］在分子水平上引发“严格反应”，这种应激反应使细菌细胞发展成持久表型，赋予细菌抗生素抗性，使其能够适应环境变化和压力条件^［19］，因此，开发（p）ppGpp抑制剂是一个活跃的研究领域，Tkachenko等^［35］发现合成的二萜类似物4-（4，7-二甲基-1，2，3，4-四氢萘-1-基）戊酸能够抑制和根除分枝杆菌生物膜。上述化合物是肽和小的有机化合物，容易受到酶降解以及pH值变化的影响而失去活性，应用纳米技术等高新生物工程手段设计能够克服上述障碍的热力学稳定的药物递送系统具有潜在的临床应用价值。

综上，本文总结了DFU慢性伤口的形成、生物膜附着的问题，并简要叙述了近期研制的新型敷料。DFU伤口慢性化，给患者与社会经济带来沉重负担，生物膜在DFU伤口中的作用越来越受到重视，由于与EPS保护屏障和生物膜内部的QS感应，感染明显比浮游细菌引起的感染更难治疗。材料学和生物学之间的交叉对于解决临床问题具有重要意义，在生物材料科学领域，应用纳米技术的敷料处于高速发展阶段，相关的敷料在实验阶段表现出了非凡的治疗效果，但由于NP可能存在细胞毒性，目前未在临床大规模应用于DFU治疗，近年来NP合成和包装技术取得了非凡的进展，通过控制NP的直径或对其进行封装，有望打破这一桎梏，未来需要高质量证据来验证其在DFU中的临床应用价值。新型敷料为DFU提供新的治疗思路，减少抗菌药物的应用及耐药菌的产生，针对不同的DFU患者，在降糖、抗感染、延缓神经病变、改善下肢血供等治疗基础上定制合适的敷料将会是未来的发展趋势。

参考文献略