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▲第一作者：Paul Greife, Matthias Schönborn, Matteo Capone通讯作者：Leonardo Guidoni，Holger Dauhttps:///10.1038/s41586-023-06008-5光合作用以化学形式储存太阳能，为地球上的生命提供燃料。今天的富氧大气是光合作用过程中光系统 II 的蛋白质结合锰团簇分解水的结果。分子氧的形成始于具有四个累积电子空穴的状态，即 S4 状态——这是半个世纪前的学者假设的，至今仍未被实验证明。本研究解决了光合形成O2的这个关键阶段及其重要的机制作用。本研究使用微秒红外光谱跟踪了暗适应光系统的 230,000 个激发循环。将这些结果与计算化学相结合表明：关键的质子空位最初是通过门控侧链去质子化产生的。随后，在单电子、多质子转移过程中形成活性氧自由基。这是光合 O2 形成中最慢的一步，其具有适度的能垒和明显的熵减慢（entropic slowdown）。本研究将 S4 状态识别为氧自由基状态；它形成之后是快速的 O-O 键合和 O2 释放步骤。结合先前在实验和计算研究方面的突破，本研究绘制了令人信服的光合 O2 形成的原子图。本研究结果提供了对过去 30 亿年可能发生变化的生物过程的见解，期望它能为基于原理的人工水分解系统设计提供支持。1.在所有植物、藻类和蓝藻中，阳光驱动水分子分裂成高能电子和质子，这两者都是减少二氧化碳和最终形成碳水化合物所必需的。分子氧 (O2) 在此过程中形成，它在大约 24 亿年前开始的“大氧化事件” 期间改变了地球的大气层。光驱动的水氧化发生在放氧复合物中，这是一种与光系统 II (PSII) 的蛋白质结合的 Mn4CaO5 簇。在 O2 形成的瓶颈步骤中，电子和质子转移之间的关系仍未完全了解。本研究在这里使用时间分辨傅里叶变换红外 (FTIR) 实验解决了这个关键步骤（图 1）。2.为了在 PSII 上进行时间分辨红外光谱表征，本研究开发了一个 FTIR 步进扫描实验，自动交换暗适应的 PSII 粒子，从而扩展了以前在单个波数上的实验，来检测完整的指纹光谱。样本交换系统大约每 60 小时使用 PSII 膜颗粒重新填充约 1.5 克叶绿素，这些叶绿素来自 40 千克新鲜菠菜叶，在 7 个月内日夜收集数据。本研究通过应用于暗适应光系统的 10 个可见光（532 nm）纳秒激光闪光启动了半稳定 S 状态之间的转换。使用基于 Kok 标准模型 （图 1a）的特定反卷积方法，本研究获得了四个半稳定反应循环中间体 S1、S2、S3 和 S0 之间每个单独转变的时间相关 S 态差异光谱。1.为了对通过 FTIR 步进扫描实验获得的二维时间波数数据阵列进行系统分析，本研究利用了质子去除时间常数 (tH+ = 340µs) 和与 O2 形成相关的电子转移 ( tO2 =2.5 ms)，因为它们总是反映相同的反应（相同的速率常数）。因此，时间常数可以作为时间分辨光谱数据中反应的动力学标签。通过在每个波数使用同一组时间常数同时模拟 2,582 个波数（1,800 cm−1 至 1,200 cm−1）的时间过程，本研究获得了图 2b-d 所示的振幅谱，表示为衰变相关光谱（DAS）。2.在激光闪光后数百毫秒收集的传统稳态 S 态差异光谱可以反映直接与稳定的光诱导的锰离子氧化态变化相关的变化，并由协调的蛋白质侧链感知，正如通常假设的那样。然后，稳态差异光谱应对应于 tO2 分量的 DAS（2.5 毫秒），如图 2d ，支持分配给 Mn-或 Ca-结合羧酸盐侧链。然而，在其他光谱区域，本研究观察到不同的行为：在 tO2 振幅谱中，(1) 正峰位于 1,700–1,750 cm−1（图 2b）和 (2) 负峰位于 1,565–1,605 cm−1 。这与稳态谱中的对应物不匹配（图 2c)。这些峰可能归因于 (1) 质子化羧酸侧链的振动和 (2) 羧酸盐去质子化侧链。1.计算出的 MEP 包括三个亚稳态（i、ii 和 iii）和两个转变，如图 3 所示。在第一个转变（i → ii）中，电子转移（到 TyroxZ）与 Mn 结合的质子转移耦合氢氧化物 (Mn1(IV)-O6H) 与特定的水分子 (W2) 结合，导致氧自由基末端与 Mn 离子 (Mn1(IV)-O6·) 结合。TyroxZ 空穴向 O6 的转移构成了一个电子从而形成对底物-水氧的氧化。由此达到的 S4 状态不能被视为过渡状态，而是反应中间体，它在 ab initio 分子动力学模拟的 10-ps 轨迹上是稳定的。最终，通过氧-氧基偶联和过氧化物形成达到最终状态（iii）。2.与之前的研究相比，本研究对 i → ii 转变的 MEP 计算并不局限于 Mn4Ca-oxo 簇及其直接配体环境的局部事件。它们还包括电子转移步骤——即同时进行 TyrZ 还原和 O6 氧化，以及四个质子从初始氢键供体到氢键受体的耦合转移。TyrZ 和 Mn4Ca-oxo 簇周围的核重排不是孤立的事件，而是通过包含在MEP计算的量子区域中的氢键水分子簇相互联系。本研究不同于以往的研究，因为它在实验结果和计算分析得出的事件序列和反应动力学之间建立了密切联系。本研究将光合水氧化中的速率决定步骤确定为 Mn(IV)-O⦁ 自由基的形成，这对应于底物水分子的单电子氧化。通过三个质子的 Grotthus 型重定位，电子转移和 Mn-OH 去质子化之间的紧密耦合促进了低焓反应势垒，计算出的势垒数值与实验发现的一样低。协同电子-质子反应要求活性位点的原子核和氢键模式完美排列，这为熵因子导致的反应减慢提供了合理的解释。在计算上，本研究确定了随后的过氧化物形成的低能量路径，这与 Siegbahn 等人的思想一致，但本研究发现这不是整体速率决定步。然而，本研究不能完全排除形成 O-O 键的进一步低能量途径，这是因为它们也已在与底物-水交换率相关的方面进行了讨论，而且无法实现涵盖所有可能的反应路径的详尽搜索。以前的研究没有考虑与 Mn-OH 去质子化和 Mn(IV)-O⦁ 自由基形成相关的联合焓-熵屏障的机械特征，本研究确定了作为光合水氧化中动力学要求最高的总体瓶颈步骤。
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