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生科云网址：https://www./ 编译：微科盟 思琦，编辑：微科盟 景行、江舜尧。 微科盟原创微文，欢迎转发转载，转载请注明来源于《转录组》公众号。 论文ID 实验设计
结果 1 通过病理学知情取样策略获得的胃癌代表性单细胞转录组图谱 研究者对手术切除的癌症样本中的14个组织，包括1个正常黏膜组织、6个分化的癌症（DGC）组织、6例低分化的癌症（PDGC）组织和1个神经内分泌癌（NEC）组织，采用病理学知情取样策略并进行了基于液滴的scRNA-seq（10X Genomics），样本均通过组织病理学检查得到证实（表S1）。神经内分泌癌组织和相应的腺癌组织来自病理诊断为混合型腺神经内分泌癌（MANEC）的同一肿瘤。 经过严格的质量控制，保留了46883个细胞用于进一步分析，每个细胞的中位值基因数和特异性分子标记（UMI）分别为1723和5480（图S1A）。降维聚类后，基于公认的标记基因的表达识别出8个细胞簇，捕获的细胞明显分为上皮细胞（EPCAM和KRT8）、成纤维细胞（THY1和DCN）、内皮细胞（PECAM1和CDH5）、髓系细胞（C1QA和CD163）、T/NK细胞（CD3D和CD3E）、B细胞（CD79A和MS4A1），浆细胞（MZB1）和肥大细胞（KIT和TPSAB1）（表S2和图1A，B）。这些细胞类型的百分比在肿瘤样本中有所不同，上皮细胞和T/NK细胞占大多数（图S1B-E）。 研究者在数据中捕获了一个正常黏膜组织，并根据公认的细胞标记将该样本的上皮细胞分为祖细胞、表面细胞、主细胞、壁细胞和内分泌细胞（图1C和图S1F）。然后，研究者评估了肿瘤组织上皮细胞的CNV水平，每个肿瘤样本中都存在高CNV和低CNV上皮细胞（图1D，E）。通过相应激光捕获显微切割组织的WES数据证实了高CNV的细胞（图S2A）。为了对恶性细胞和非恶性上皮细胞进行分类，研究者将聚类和CNV数据相结合，将恶性细胞与非恶性细胞区分（图S1G，H），得到11个恶性细胞簇和7个非恶性细胞簇（表S3、图1F和图S1I，J）。来自不同患者的肿瘤样本中的非恶性上皮细胞与来自正常黏膜的上皮细胞聚集在一起，而恶性细胞聚集在一起并与非恶性上皮细胞簇分离（图S2B，C）。通过比较恶性和非恶性上皮细胞，研究者发现恶性细胞失去了消化和防御功能，但增强了蛋白质合成活性和代谢（表S4和图1G，I）。研究者还评估了恶性和非恶性细胞的基因调控网络（GRN），并根据不同患者对上皮细胞进行分类的GRN对其进行聚类（图S2D）。在恶性细胞中鉴定出GRN，如YY1、RAD21、RARG、TP63和CERBPB，而在非恶性上皮细胞中鉴定了几种GRN，包括SP1、IRF7、IRF9、FOXA1和KLF2（图1H）。 研究者评估了恶性细胞簇的不同特征，发现内分泌细胞具有一些胰腺β细胞样特征，表现出与分泌相关的特征（图1J和图S2G）。此外，T1和T6簇代具有干扰素α和γ反应特征，这意味着T1和T6集群显示出独特的免疫相关特征（图1J，K和图S2E，F）。研究者还评估了上皮细胞簇中的代谢相关活性，发现T6中的甘油脂和甘油磷脂代谢活性高于其他恶性细胞簇（图S2H，I）。
2 通过比较DGC与PDGC来确定癌细胞的分化特征 研究者将DGCs和PDGC的转录组与明确的病理诊断进行比较，以阐明它们的分子差异（图2A，B）。来自PDGC和DGC的恶性细胞的DEG，CLDN3、FABP1、S100A10和PHGR1在DGC中的表达显著较高，而上皮细胞-间充质转化（EMT）相关基因如VIM、LAMB3、LAMC2，COL6A1和COL17A1在PDGCs中特异性表达，表明EMT特征在PDGC中富集（表S5、图2C、D和图S3A）。PDGC中富集了与EM相关的术语，如粘着斑、对创伤的反应、细胞迁移的正调控和细胞-细胞粘附（图2E）。与非恶性上皮细胞相比，PDGC中的上调和下调的DEG数量多于DGCs（图S3B，S3D）。此外，HIF1A主要在PDGC中表达，表明PDGC可能存在更强的缺氧（图S3E）。 为了评估DGC和PDGC的基因表达程序，研究者使用非负矩阵分解（NMF）方法分析不同癌症类型的恶性细胞。研究者发现，EMT、上皮相关和代谢/能量程序在PDGC中富集，基因富集分析证实了这一点，而吸收/运输、细胞周期、胞吞、白细胞介素相关信号、代谢/能量、蛋白质成熟、蛋白质加工和对外部刺激程序的反应在DGC中富集（图2F）。 基于与DGC恶性细胞高度相关的上调基因，研究者使用lasso回归和随机森林方法来去除低贡献基因。最后，研究者确定了与胃癌分化状态相关的基因集，包括AGR3、CLDN3、CLDN 4、FABP1、LGALS4、PHGR1、MYH14和S100A14（表S6和图S3F，G）。已确定的肿瘤分化基因集在DGC中的表达明显高于在PDGC（图2G和图S3H）。该基因特征清楚地定义了DGC，尤其是数据集中的T1和T6簇（图2H）。此外，研究者提出了一种基于所有恶性细胞上调标志物的评分作为肿瘤评分。肿瘤评分与肿瘤分化基因集呈负相关，这表明癌症细胞分化水平越高，肿瘤的恶性程度越低（图2I）。此外，在TCGA数据库中，分化基因集的高表达与肠型胃癌的整体生存率较高显著相关（图2J）。
3 分化特征与免疫浸润相关基因部分重叠 接下来，为了研究癌细胞的分化特征与相应免疫微环境特征之间的关系，研究者根据肿瘤浸润CD8 T细胞的密度将患者分为免疫低下型和免疫丰富型。研究者发现，恶性细胞在免疫低下型的比例更高，这表明免疫低下肿瘤中的恶性细胞密度很高，如H＆E染色所示（图3A，B）。研究者在免疫低下型中确定了S100A2、CAV1、CAV2和ANXA1等标记和GO术语，包括粘着斑、整合素相关通路和对创伤的反应，而在免疫丰富型中确定了LAGLS4、CLDN3和PIGR等基因和GO术语包括粒细胞迁移、中性粒细胞降解和胞吞（表S7、图3C和图S4A）。此外，使用TCGA数据集中MSI-H和MSI-L的癌症样本来确认免疫低下型和免疫富集型之间的DEGs，正如预期的那样，免疫低下型肿瘤组织中的恶性细胞标记物在MSI-L样本中有较高的表达，而免疫富集型肿瘤组织中的恶性细胞标志物在MSI-H样本中有更高的表达（图3D）。免疫丰富型和免疫低下型的恶性细胞在恶性簇中的百分比不同，免疫丰富型肿瘤组织中的恶性细胞在T1、T6和T7簇中富集（图S4C）。此外，研究者根据免疫相关基因集分析了恶性细胞的拟时序轨迹，并确定了恶性细胞从免疫丰富型到免疫低下型的轨迹，表明这两种类型之间的连续转变（图S4B）。 研究者利用免疫反应的几个标志性特征和GO基因集对免疫丰富型和免疫低下型的肿瘤细胞进行评分。免疫丰富型肿瘤中的癌细胞往往具有较高的干扰素α和干扰素γ相关基因表达（图3E和图S4D）。干扰素γ相关基因（包括CCL20、CCL25和CD74）和抗原呈递相关基因（如HLA-DPA1、HLA-DRA和HLA-DRB）在免疫丰富型肿瘤的癌症细胞中显著上调（图3F）。此外，为了确定肿瘤细胞对浸润性T细胞的反应，研究者研究了耗竭和共刺激受体，发现与免疫低下型相比，免疫丰富型肿瘤的癌细胞显示出相应的耗竭配体相关和共刺激配体相关基因的更高表达（图3G）。同时，与耗竭配体和共刺激配体基因集高度相关的标志性基因特征在免疫相关活性中富集，如干扰素γ反应、干扰素α反应、炎症反应和补体活性（图3H）。研究者还在TCGA数据集中筛选了这些特征，发现MSI-H胃癌样本中干扰素α/γ应答基因、耗竭配体和共刺激配体基因表达更高，这些样本的特征是高度免疫浸润（图3I）。 从热图中可以看出，免疫低下型和免疫丰富型之间的DEGs总体上与PDGC和DGC之间的DEGs重叠，并且免疫丰富型中的恶性细胞比免疫低下型的恶性细胞具有更高的分化得分（图3J，K）。研究者还确定了与干扰素γ和干扰素α通路高度相关的基因，它们在免疫丰富型和免疫低下型的恶性细胞中差异表达（图S4E）。例如，PHGR1和CLDN3在免疫丰富型的恶性细胞中表现出更高的表达，并且主要在T1和T6簇中表达（图S4F）。同时，在TCGA数据库中，它们的表达与肠型胃癌的更好预后相关（图S4G）。最后，研究者还确定了与干扰素α/γ信号高度相关的代谢活性，并发现脂质相关特征，如视黄醇代谢和类固醇激素生物合成，与免疫丰富型呈正相关（图S4H，I），而丙酮酸相关特征，如嘌呤代谢、丙酮酸代谢和嘧啶代谢，与免疫丰富型呈负相关。
4 肿瘤浸润性T细胞的特征及其与恶性细胞的相互作用 为了详细描述NK/T细胞簇以及T细胞和恶性细胞之间的联系，研究者分析了所有T细胞，并根据相应的标记将其分为17个簇，包括3个NK或γ/δT细胞簇、4个CD8 T细胞簇，6个CD4 T细胞团簇和4个具有其他特定特征的T细胞簇（图4A，B）。这些簇在不同的肿瘤样本中分布相对均匀（图4C）。在这些T细胞簇中，STMN1 T细胞代表细胞周期特征，并包含CD8 T和CD4 T细胞（图S5A）。对于四个CD8 T细胞簇（GZMB CD8 T细胞、GZMH CD8 T细胞、GZMK CD8 T细胞和TNFSF9 CD8 T细胞），GZMB CD8 T细胞和GZMH CD8 T细胞比其他细胞具有更强的细胞毒性能力，而与其他CD8 T细胞相比，GZMB CD8 T细胞具有特定的耗竭特征（图4D）。研究者筛选出了主要在GZMB CD8 T细胞中表达的耗竭相关基因，如PDCD1、CTLA4和HAVCR（图S5B）。 DGC和免疫丰富型的T细胞是捕获的大部分T细胞（图4E）。此外，所有四种主要功能性CD8 T细胞类型都在免疫丰富型中显著富集，这与病理结果一致（图S5C，D）。研究者发现，来自免疫丰富型的GZMB CD8 T细胞CXCL13的表达较高（图4F和图S5E），据报道，这可能与三阴性乳腺癌免疫治疗的良好反应有关。此外，研究者发现能量产生功能，如氧化磷酸化、糖酵解/糖异生和柠檬酸循环，与细胞毒性和耗竭特征呈正相关（图S5F，G），表明CD8 T细胞的细胞毒性和耗竭功能可能消耗更多的能量。 然后，研究者对细胞间通信进行了深入分析。对于不同的恶性细胞簇和CD8 T细胞簇，研究者发现耗竭相关配体主要富集在T1、T4和T6恶性细胞簇中，耗竭相关受体主要富集在GZMB CD8 T细胞中，尤其是LAGLS3-LAG3、CEACAM1-HAVCR2和NECTIN4-TIGIT等相互作用，这表明恶性细胞和CD8 T细胞参与了T细胞耗竭（图4G）。关于免疫类型和不同类型的CD8 T细胞之间的通讯，研究者确定了恶性细胞和GZMB CD8 T细胞与耗竭相关的相互作用，而相应的配体分布在免疫低下和免疫丰富的恶性细胞中，尤其是LAGLS3-LAG3和HLAB-KLRD1等相互作用（图4G）。此外，研究者还确定了恶性细胞和CD4 T细胞之间的相互作用。NECTIN4-TIGIT和MYL9-CD69等相互作用分布在几乎所有不同类型的恶性细胞和CD4 T细胞的相互作用中，但它们在CXCL13 CD4 T细胞中更具特异性（图S5H）。
5 混合型腺神经内分泌癌分化状态的转变 在测序的12名患者中，2名患者患有MANEC，其被定义为一种胃癌，具有典型腺癌和神经内分泌癌的形态学和免疫表型特征。结合形态学和免疫组化分析，研究者确定了这2种MANEC肿瘤中的三种主要成分：分化型腺癌、中间状态癌细胞和神经内分泌癌。中间状态癌细胞是指在形态上介于分化型腺癌和神经内分泌癌之间，但不表达分化型腺癌（MUC5AC和MUC6）或神经内分泌癌（Syn和CgA）标记的肿瘤成分，尽管在病理检查中为分化型腺癌（图5A）。 由于两名患者均有分化型胃腺癌和神经内分泌癌成分，研究者结合分化型胃癌、中间状态和神经内分泌癌的单细胞转录组数据探讨神经内分泌成分的来源。在数据集中分析了DGC和NEC之间的DEG和差异表达的TF，并鉴定了内分泌相关特征和NEC特异性基因，如CGA、CHGA和CHGB，以及NEC特有的TF，如HMGN3、HOXD11和FEV（图S6D）。所有上皮细胞的PCA减少显示出从分化的胃腺癌转变为中间状态，然后转变为神经内分泌癌（图S6A）。基于PCA成分，研究者创建了所有上皮细胞从非恶性上皮细胞（DGC到NEC）的拟时序轨迹，识别出上皮细胞的三种状态及其不同的特征（图5B）。研究者确定了随着转分化逐渐变化的基因。KRT20、PHGR1、PIGR和CLDN3逐渐下调，而PDCD5、CPNE1、PDCD2、GLO1、APOA1和CGA上调（图5C和图S6B），表明随着神经内分泌标志物表达的增加，分化评分逐渐降低。分化相关的转录因子如KLF2、KLF3和FOXA3被下调，内分泌相关转录因子，如HOXA7、FEV和LMX1A随着转分化逐渐上调（图5D）。特别是，免疫疗法的潜在靶点，包括MUC1、CEACAM5和CLDN18，随着转分化逐渐下调。相反，CTAG2是一种癌-睾丸抗原，并逐渐上调（图5F）。此外，根据TCGA数据集，APOA1和CGA的表达与胃癌的预后较差相关，CGA是NEC的典型标记物（图5G）。研究者注意到，中间状态的恶性细胞既不表达公认的DGC特征基因（MUC1、KRT20、PHGR1），也不表达NEC特征基因（SCG3、CGA、CHGB），这与上述形态学和免疫组织化学染色结果一致。标志基因集结果显示了转分化的变化特征，并且未折叠蛋白反应、脂肪酸代谢、糖酵解和MYC靶标等特征在中间状态中显著富集（图5E）。包括LGALS1、DDIT4和EIF4G1在内的几个基因也在中间状态下富集（图S6C）。 在DGC到NEC的转分化过程中也发现了干扰素相关通路的负相关（图5E和图S6E，F）。恶性细胞中免疫应答的减少伴随着IHC染色中CD8 T细胞浸润的减少（图S6B）。干扰素相关通路中特异性基因的分析也证实了类似的相关性，如CASP1、CD74、B2M、ITM3和I27的表达，它们与NEC特征呈负相关（图S6G）。
6 胃癌髓系细胞的转录组特征 巨噬细胞占髓系细胞的主要部分（鉴定出9个簇，具有不同的标记基因，如FCN1、C1QA、CCL18、HSPA18、SPP1、CXCL10、INHBA、CDKN1C和MT1G），根据相应的标记基因还鉴定了其他细胞簇，如CD1C DC、CCR7 DC、LTB DC、FCGR3B 中性粒细胞和循环髓系细胞。其中，FCN1 巨噬细胞和C1QA 巨噬细胞在髓系细胞中所占比例最大（图6A，C）。对于巨噬细胞，几个基因集，如M1极化基因集、M2极化基因集，促炎基因集和抗炎基因集，用于对巨噬细胞进行评分，所有巨噬细胞簇都倾向于表现出M2极化特征（图6B）。研究者确定了上述特征与代谢活性的具有正相关，如脂肪酸生物合成和烟酸相关代谢，以及与能量代谢的不同相关性，如TCA循环和氧化磷酸化（图6D）。 此外，研究者筛选了髓系细胞在不同分类中的分布，如DGCs和PDGC，以及免疫丰富型和免疫低下型。研究者观察到，与免疫丰富型相比，免疫低下型INHBA 巨噬细胞的比例增加，与DGCs相比，NECs中INHBA 巨噬细胞比例增加，这与上述发现一致，表明INHBA 巨噬细胞可能通过抑制免疫反应影响胃癌（图6E，F）。最后，研究者确定了恶性细胞和巨噬细胞的配体-受体相互作用对。对于免疫丰富和免疫低下型的恶性细胞，研究者在CDKN1C 巨噬细胞-恶性细胞和CXCL10 巨噬细胞-恶性细胞对中确定了TNFSF10-TNFRSF11B的特异性相互作用，这对应了TNFRSF11B在免疫应答中的抑制功能（图6G）。
讨论 本研究的病理知情采样策略提供了测序的肿瘤组织的确切病理信息，以最大限度地减少肿瘤内高异质性的影响，从而更好的区分DGC和PDGC以及免疫低下型和免疫丰富型。此外，研究者从RNA数据推断的CNV信息也可以通过激光捕获显微切割相应组织的WES数据进行验证。利用这一点和单细胞测序技术，研究者通过结合聚类和CNV信息来明确区分恶性细胞和非恶性上皮细胞，并实现对肿瘤细胞更准确的聚类。通过比较DGC和PDGC，研究者确定了PDGC中富含的EMT特征，这与低分化状态相关的恶性类型一致。更有趣的是，研究者的分化特征与通过比较免疫丰富型和免疫低下型筛选出的免疫浸润相关基因重叠。 本研究中最有趣的发现是混合型腺神经内分泌癌分化状态的转变。研究者构建了从DGCs到NEC的所有恶性细胞的拟时序轨迹，并确定了随着转分化逐渐变化的基因，表明其趋向于Nikolas etal报道的小细胞神经内分泌状态。作为免疫疗法的潜在靶点的MUC1、CEACAM5和CLDN18逐渐下调，表明在神经内分泌分化过程中，免疫攻击的逃避越来越多。中间状态的恶性细胞显示DGC和NEC标记基因的双阴性特征，代表可能与胃癌进展相关的“干细胞/祖细胞”特征。与前列腺癌和非小细胞肺癌的研究类似，发现很多转录因子在转分化过程中差异表达。新发现是DGC到NEC转分化过程发现的干扰素相关通路呈负相关，这伴随着IHC染色中CD8 T淋巴细胞浸润减少，支持神经内分泌分化作为胃癌免疫逃避机制，未来需要进一步的功能研究。
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