Nat Commun | 长期服用他汀类药物会导致异位脂肪沉积从而加剧糖尿病肾病

aiaiweiwei 2023-05-19 发布于新疆

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2型糖尿病(T2DM)患者容易并发高脂血症，机体中游离脂肪酸、胆固醇和甘油三酯水平升高，组织中脂肪过度沉积。高脂血症可通过多种途径导致慢性肾病，ESC/EVA指南提出，建议高危T2DM患者服用他汀类药物调节血脂。然而，他汀类药物对糖尿病肾病进展的影响仍存在争议。近年来，大量研究报道他汀类药物会加重胰岛素抵抗和干扰糖代谢，使用他汀类药物的人患新发2型糖尿病的风险增加。最近，中山大学中山医学院蔡卫斌教授团队发表在Nature Communications的文章“Long-term statins administration exacerbates diabetic nephropathy via ectopic fat deposition in diabetic mice”报道了长期服用他汀类药物会激活SREBP-1脂肪酸合成信号，增加肾脏脂质摄取，抑制脂肪酸氧化，从而加剧糖尿病小鼠肾脏异位脂肪沉积。

（图片来源：Nature Communications）

长期服用他汀类药物会加重

db/db小鼠的胰岛素抵抗

作者首先建立了db/db小鼠、STZ诱导的T2DM小鼠和KK-Ay小鼠三种糖尿病小鼠模型，并给予他汀类药物50周(图1a)。结果显示，db/db小鼠在服用他汀类药物后体重开始逐渐下降，且随着时间的推移，死亡率开始显著增加(图1b和1c)。此外，db/db小鼠空腹血糖(FBG)水平在给药后显著升高(图1d)，给予阿托伐他汀或瑞舒伐他汀后db/db小鼠糖化血红蛋白(GHbA1c)水平显著升高(图1e)。ITT结果显示，两种他汀类药物给药组小鼠胰岛素抵抗显著加重(图1f)；肾脏免疫组化染色结果显示，长期服用他汀类药物显著增加了肾脏晚期糖基化终末产物(AGEs)水平(图1g和1h)。以上结果表明，长期服用他汀类药物会加重糖尿病小鼠的胰岛素抵抗，并增加其死亡率。

图1 长期服用他汀类药物会加重

db/db小鼠的胰岛素抵抗

长期应用他汀类药物加重

db/db小鼠肾损伤

连续给药50周后，他汀组db/db小鼠肾脏明显萎缩和变形(图2a)。PAS、Masson染色和电子显微镜结果显示，他汀组db/db小鼠出现肾小球肥大、肾小球系膜明显扩张、肾小球毛细血管基底膜(GBM)增厚、部分基底膜断裂，毛细血管环扩张等典型病理改变。此外，他汀类药物组小鼠肾小球脏层上皮细胞丢失增加；分子水平上，肾小球脏层上皮细胞相关蛋白Nephrin显著下调(图2b-2j)。尿白蛋白肌酐比(UACR)、肾损伤分子-1(KIM1)水平和肾小球滤过率(GFR)是评估糖尿病肾损害的经典指标，结果显示，与对照组相比，他汀类药物治疗组小鼠尿中KIM1水平从第19周开始升高，与UACR结果一致，血清肌酐水平也显著升高，GFR显著降低(图2l-2n和2k)。以上结果表明，长期服用他汀类药物会加重糖尿病小鼠的肾脏损伤。

图2 长期服用他汀类药物会加重

db/db小鼠的肾脏损伤

长期服用他汀类药物会加重

db/db小鼠肾脏纤维化

为探究他汀类药物长期诱导的肾脏损伤的原因，作者进一步检查了肾脏纤维化。除Masson染色和Sirius Red染色外，作者还检测了I型胶原(COL1A1)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达。结果显示，给药组小鼠肾纤维化面积显著增大，COL1A1和α-SMA表达显著增加。以上数据进一步证实，长期服用他汀类药物会加剧糖尿病小鼠肾脏纤维化，从而导致肾脏损伤。

图3 长期服用他汀类药物加重db/db小鼠肾脏纤维化

长期服用他汀类药物加重db/db小鼠

肾脏炎症和肾小管上皮细胞凋亡

炎症是糖尿病小鼠肾脏成纤维细胞活化的关键因素，纤维化和持续炎症会加剧糖尿病肾病。作者检测巨噬细胞标记物CD68以评估长期服用他汀类药物对糖尿病小鼠肾脏的促炎作用。结果显示，他汀类药物给药组大鼠肾组织巨噬细胞广泛浸润。免疫荧光、免疫组化和免疫印迹结果显示，他汀类药物显著激活了NF-κB进入细胞核，并显著升高了IL-1β和NGAL的蛋白表达水平(图4a-4h)。TUNEL染色显示，炎症风暴导致肾小管上皮细胞凋亡(图4e)。以上结果表明，长期服用他汀类药物会加重肾脏炎症和肾小管上皮细胞凋亡，并加速糖尿病肾病的发展。

图4 长期服用他汀类药物加重db/db小鼠肾脏炎症和肾小管细胞凋亡

长期服用他汀类药物导致

db/db小鼠体内脂质蓄积

为探究长期服用他汀类药物是如何导致db/db小鼠肾脏损伤的，作者使用RNA-Seq来分析Db对照组和Dd+Ato10组小鼠的肾脏。结果显示，与Db组相比，他汀类药物组小鼠肾脏多种参与脂质代谢的基因显著富集(图5a)。随后，作者检测了肾脏甘油三酯水平，发现他汀类药物组的小鼠肾脏TG水平显著高于Db组(图5b)。荧光结果显示，长期服用他汀类药物增加了db/db小鼠肾脏对游离脂肪酸(FFAs)的摄取，提示其可能导致脂质沉积(图5c)。此外，油红O染色结果显示，与Db组相比，他汀类药物组小鼠脂滴(LDs)沉积加剧(图5d)；与油红O染色结果一致，透射电子显微镜(TEM)观察到肾小管上皮细胞中LDs沉积增加(图5e)。4-HNE是一种有毒的脂质过氧化最终产物，在肾脏中积聚可加重肾脏损害。4-HNE免疫组化染色和DHE染色结果表明，LDs的大量沉积导致活性氧物种(ROS)的过度生成，进一步导致脂质过氧化产物4-HNE的过度产生，从而激活肾脏的炎症反应，最终导致肾脏纤维化(图5f和5g)。以上结果表明，他汀类药物可加重糖尿病患者肾脏LDs的沉积。

图5 长期服用他汀类药物导致

db/db小鼠体内脂质蓄积

长期服用他汀类药物增加

db/db小鼠肾脏脂肪摄取并抑制FAO

为了进一步探究肾脏的脂质沉积，作者首先检测了小鼠血清脂质水平。他汀类药物组小鼠血清TCHO、TG和LDL水平显著低于Db组(图6a)。免疫组织化学和免疫印迹结果显示，他汀类药物显著上调了db/db小鼠肾脏HMGCR、LDLR和跨膜蛋白CD36(清道夫受体B2)的表达水平(图6b-h)，提示肾脏脂质摄取增加可能与他汀类药物诱导的LDs沉积有关。为探究他汀类药物诱导的LDs沉积是否与LDLR上调有关，作者构建了LDLR敲除小鼠，并用STZ诱导T2DM模型，发现长期服用他汀类药物后小鼠血脂水平显著降低(图9a)。Nile Red染色结果显示肾脏LDs沉积显著减少(图9b)，提示LDLR表达上调可能与他汀类药物诱导的肾脏LDS沉积有关。

脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)是脂肪分解的限速酶，ATGL缺陷的小鼠表现出蛋白尿并伴有肾内脂肪的异位沉积。肉碱棕榈酰转移酶1α(CPT1)是脂肪酸氧化(FAO)的限速酶，抑制FAO在肾小管上皮细胞中的表达会导致细胞耗竭、细胞死亡、去分化和细胞内LDs沉积。作者发现，长期服用他汀类药物显著降低了小鼠肾脏ATGL和CPT1α的表达(图6e、6i和6j)，进一步加剧了LDs的沉积。综上所述，虽然长期服用他汀类药物能够显著降低血脂水平，但同时也激活了肾脏中胆固醇的合成和内吞，并进一步抑制了FAO和脂解作用，导致LDs在肾脏中沉积。

图6 长期服用他汀类药物可降低db/db小鼠的胆固醇水平，但会增加肾脏的脂肪摄取并抑制FAO

他汀类药物通过PI3K/Akt/mTOR

通路激活db/db小鼠体内的SREBP-1

肾脏组织中的脂质水平不仅与血浆脂质水平和摄取能力有关，还取决于肾脏脂质的合成和代谢。如前所述，长期服用他汀类药物可通过增加肾脏对脂质摄取和减少FAO而导致LDs沉积。由于SREBP-1可促进脂肪酸合成酶(FAS)和促纤维化细胞因子TGF-β的表达，进而促进肾脏脂质沉积和细胞外基质积聚。免疫组化和免疫印迹结果显示，长期服用他汀类药物显著增加SREBP-1的表达，SREBP-1下游的硬脂酰辅酶A脱饱和酶1(SCD1)、乙酰辅酶A羧基酶1(ACC1)和FAS的表达也显著增加(图7a-7e)。

SREBP-1的转录主要受胰岛素信号通路 (如PI3K/Akt/mTOR)调控，那么他汀类药物对SREBP-1的激活是否依赖于PI3K/Akt/mTOR通路呢？免疫印迹结果显示，长期服用他汀类药物显著增加了PI3K的磷酸化，并激活了其下游的激酶(包括Akt和p70s6k)的活性(图7d和7e)。接着在HK-2细胞中进行进一步验证，作者首先用2.4 μM胰岛素处理细胞24h，然后用120 μM油酸处理24h，与体内结果一致，SREBP-1通过PI3K/Akt/mTor通路被显著激活。

图7 长期服用他汀类药物通过PI3K/Akt/mTOR

通路激活db/db小鼠的SREBP-1

此外，在Akt1/2/3抑制剂MK-2206 2HCI(1/10 μM)和mTOR抑制剂CCI-779(1/10 μM)作用下，下游激酶Akt和p70s6k表达显著降低(图8b和8c)。BODIPY染色结果显示，经胰岛素处理的HK-2细胞胞内LDs沉积加剧，SREBP-1被显著激活；而添加以上抑制剂可显著减少LDs沉积，并抑制SREBP-1的表达(图8a-8c)。以上结果表明，肾脏通过PI3K/Akt/mTOR通路激活SREBP-1来调节LDs的沉积。

图8 在HK-2细胞中激活SREBP-1可加重脂质沉积

LDLR或SREBP-1缺失能减轻

他汀类药物所致的肾脏脂质沉积

为探究他汀类药物诱导的LDs沉积是否与SREBP-1上调有关，作者使用STZ诱导SREBP-1敲除小鼠的T2DM模型，发现长期服用他汀类药物后糖尿病小鼠血脂显著降低(图9a)。PAS和Masson染色结果显示，在SREBP-1被敲除后，糖尿病小鼠长期服用他汀类药物显示出明显的肾脏保护作用。与WT组相比，STZ组小鼠肾小球系膜明显扩张，肾纤维化明显加重，而STZ+ATO10组小鼠肾损伤更为严重。相反，与STZ组相比，LDLR和SREBP-1敲除后，小鼠的肾小球系膜扩张无明显变化，肾脏LDs沉积显著减少，表明SREBP-1上调可能与他汀类药物诱导的LDs沉积和肾脏损伤有关(图9b-9g)。

图9 LDLR或SREBP-1敲除能减轻糖尿病小鼠长期使用他汀类药物所致的肾脏脂质沉积

总的来说，本研究报道了长期服用他汀类药物可能会加重胰岛素抵抗，干扰机体脂代谢，从而导致炎症、肾脏纤维化和异位脂肪沉积，最终加剧糖尿病肾病。从机制上讲，调节胰岛素的PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活导致脂肪酸合成增加；此外，他汀类药物的应用增加了机体对脂肪的摄取，抑制了脂肪酸的氧化，最终导致了脂肪沉积。该研究提示，T2DM患者应该定期监测血糖和糖化血红蛋白水平的变化，以降低长期服用他汀类药物的风险。

参考文献：Huang TS, Wu T, Wu YD, Li XH, Tan J, Shen CH, Xiong SJ, Feng ZQ, Gao SF, Li H, Cai WB. Long-term statins administration exacerbates diabetic nephropathy via ectopic fat deposition in diabetic mice. Nat Commun. 2023 Jan 24;14(1):390.