【原】学术争论-关于(2021-4)香港重要文献：发现COVID-19新的受体-AT1R和VPR的争论

Evidence in favor of the essentiality of human cell membrane-bound ACE2 and against soluble ACE2 for SARS-CoV-2 infectivity

证据支持人类细胞膜结合ACE2的重要性，而非可溶性ACE2在SARS-CoV-2感染中的作用

VS

Soluble ACE2-mediated cell entry of SARS-CoV-2 via interaction with proteins related to the renin- angiotensin system

可溶性ACE2介导的SARS-CoV2通过与肾素-血管紧张素系统相关蛋白的相互作用进入细胞

        最近，Yeung等人(2021年)在《细胞》杂志上发表了一篇题为“可溶性ACE2介导的SARS-CoV2通过与肾素-血管紧张素系统相关蛋白的相互作用进入细胞”的论文，报告了可溶性血管紧张素转换酶2 (ACE2)的分泌形式可以促进SARS-CoV-2的传染性(Yeung等人，2021年)。ACE2以细胞膜结合的形式是SARS-CoV-2进入细胞的主要受体。然而，Yeung等人(2021年)报告称，在允许的人类细胞系(hk2细胞)中，接触极低浓度的可溶性ACE2会促进SARS-CoV-2的传染性，而高浓度的ACE2则具有中和作用。高浓度可溶性ACE2对SARS-CoV-2传染性的中和作用确实证实了先前在允许的人类细胞系和人类肾脏和血管类器官中的报告(Monteil等人，2020;威索基等人，2021年)。因此，研究利用可溶性ACE2蛋白的这种诱骗作用来预防和减弱SARS-CoV-2的传染性(Hassler等人，2022年)。如果正确，Yeung等人(2021)的结论是，低浓度的可溶性ACE2实际上促进了SARS-CoV-2的传染性，这将对理解可溶性与细胞膜结合的ACE2作为SARS-CoV-2进入细胞所必需的受体的作用具有重要意义。这一结论也可能对基于施加诱骗效应的可溶性ACE2蛋白的治疗方法产生潜在的负面影响，甚至对针对与ACE2结合的SARS-CoV-2刺突蛋白的受体结合域的疫苗设计产生负面影响。我们不同意Yeung等人(2021)的结论，即低可溶性ACE2浓度会增加SARS-CoV-2的传染性，其理论原因如下，并基于我们在此报告的数据(图S1)。

        ACE2以两种形式存在:一种是与细胞膜结合的全长形式，另一种是流入体液的较短的可溶性形式，通常在血液中少量循环。两种形式都包含SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合结构域使用的相同序列，但可溶性ACE2缺乏在细胞膜上锚定所必需的跨膜结构域(Tipnis et al.， 2000)。目前对SARS-CoV-2-ACE2相互作用的理解是，SARS-CoV-2刺钉与膜结合的全长ACE2结合后，通过跨膜丝氨酸蛋白酶2 (TMPRSS2)激活导致细胞进入和病毒复制。ACE2的全长形式存在于上呼吸道的上皮细胞和肺泡中的2型肺细胞中，也在肾脏、心脏、血管和肠道中表达(Ziegler等人，2020)。正是在上呼吸道细胞中与全长ACE2的相互作用，促进了SARS-CoV-2颗粒进入细胞(Ziegler等，2020)。在Yeung等人(2021)发表论文后，我们希望解决的问题是，低水平的可溶性ACE2是否有促进SARS-CoV-2传染性的作用。

        ACE2是一种单羧基肽酶，它将血管紧张素II裂解成血管紧张素(1-7)和其他肽(Tipnis等，2000)。其生理作用是代谢这些多肽，从而防止其积累，主要是在局部组织水平。例如，在实验性肺损伤中，血管紧张素II水平升高，缺乏ACE2具有不利影响，而给予可溶性ACE2蛋白则具有保护作用(Imai et al.， 2005)。由于SARS-CoV-2感染导致的任何细胞膜结合的全长ACE2的丢失都将有利于血管紧张素II水平升高，这可能导致炎症和肺损伤恶化(Imai et al.， 2005)。还应注意的是，有报道称心血管疾病患者和COVID-19患者血浆中可溶性ACE2适度增加(Ramchand and Burrell, 2020年;Kragstrup等人，2021年)。在这些情况下血浆中可溶性ACE2水平升高的意义尚不完全清楚，但可能反映了在这些病理条件下膜结合的ACE2脱落或细胞死亡介导的ACE2释放。人体、心血管疾病患者或COVID-19患者血浆可溶性ACE2的水平可能大致在Yeung等人(2021年)研究中使用的极低浓度范围内。这可能被错误地解释为病毒可以利用可溶性ACE2进入宿主细胞。然而，SARS-CoV-2与可溶性ACE2结合不应促进体内传染性，因为可溶性ACE2与膜结合的ACE2不同，缺乏锚定在细胞膜上所必需的跨膜结构域(Tipnis等，2000年)。因此，对于循环形式的可溶性ACE2在任何浓度下促进SARS-CoV-2的传染性都没有合理的理论依据，因为当可溶性ACE2和SARS-CoV-2的复合体形成时，它不能被内化并在细胞内启动复制。

        尽管有上述考虑，但显然重要的是验证或反驳Yeung等人(2021)使用低浓度可溶性ACE2蛋白的发现。他们的结论来自对易受SARS-CoV-2感染的人类肾脏细胞系(HK-2)的研究。他们论文图S3中报告的数据显示，低浓度的0.1、1和100 ng/mL可溶性ACE2增加了SARS-CoV-2 RNA水平，高于对照。我们使用了相同的HK-2人类细胞系，试图复制相同的协议(细节由《细胞》的编辑提供给我们，因为它们在原始论文中缺乏[Yeung等人，2021年])。用可溶性ACE2预处理HK-2细胞24小时(图S1A)。随后HK-2细胞与瑞典分离的SARS-CoV-2武汉毒株(GenBank: MT093571)感染1小时。与Yeung et al.的论文(Yeung et al.， 2021)完全相同的低浓度可溶性ACE2和实验条件下，qRTPCR评估的传染性没有产生任何明显变化，并表示为模拟处理对照组的%(图S1A)。由于有两个以上的组，数据分析采用单因素方差分析，当显著性时，随后采用Dunnett多重比较检验。这是正确的统计分析，我们注意到，这不是由Yeung等人(2021年)或Monteil等人(2020年)之前的工作完成的，他们也使用了配对t检验。Yeung等人(2021)使用从Sigma (Cat#SAE0064)购买的可溶性ACE2蛋白，该蛋白与我们的蛋白质(见补充方法)一样，具有18-740氨基酸，并通过其集集素样结构域二聚体(Yan等人，2020)。因此，我们无法使用相同的细胞类型、协议和同样低浓度的可溶性ACE2来复制他们的发现(图S1A)。

        也许与人类疾病更相关的是我们使用人类肺和肾脏类器官来评估可溶性ACE2浓度在更好地复制器官生理学和病理生理学模型中的影响的发现。在这些模型中报告的实验是由不同的研究小组进行的，彼此独立。我们使用了与SARS-CoV-2进入体内的靶细胞非常相似的人类胚胎起源的肺类器官。这些类器官不仅表达受体ACE2，还表达蛋白酶TMPRSS2，这是激活和随后的内化所需的(参见补充方法)。在肺类器官中，我们检测了不同的可溶性ACE2浓度，并不仅基于qRT-PCR测定的RNA水平，还使用斑块试验评估了传染性。与PBS对照相比，测试的低可溶性ACE2浓度(包括Yeung等人(2021)使用的10 ng/ mL)对SARS-CoV-2传染性没有任何显著影响(图S1B和S1C)。相比之下，高浓度具有预期的和此前报道的强中和效应(Monteil等人，2020年;Wysocki等人，2021)，这也是由Yeung等人在HK-2细胞中发现的(Yeung等人，2021)。

        除了这些肺类器官实验，我们还使用了不同类型的人体肾脏类器官。其中一种来自野生型多能干细胞，另一种来自两种不同的ACE2敲除(KO)细胞系(Garreta等人，2021年)。从ACE2 KO细胞系衍生的肾类器官是独特的，因为它们既不表达可溶性的也不表达膜结合的全长ACE2。因此，这些ACE2 KO人类肾类器官不会被SARS-CoV-2感染，这一点由缺乏任何可检测到的核蛋白所表明(Garreta等人，2021年)。因此，这是一个理想的遗传模型系统，因为没有内源性ACE2的表达会导致实验数据的偏差;因此，如Yeung等人(2021年)所提出的那样，要通过低剂量可溶性ACE2蛋白增强SARS-CoV-2，需要存在一种除ACE2以外的受体。然而，当ACE2 KO人肾类器官暴露于SARS-CoV-2中时，我们再次没有检测到低浓度可溶性ACE2(包括10和100 ng/mL，图S1D和S1E)增强的传染性。较高浓度的可溶性ACE2对这些ACE2 KO人类肾类器官的感染性也没有影响，然而正如预期的那样，它抑制了同源野生型肾类器官的感染(图S1D S1F)。在野生型肾类器官中，低浓度的可溶性ACE2对传染性没有影响，而高浓度的ACE2具有预期的抑制作用(图S1F)。总之，我们的研究结果提供了强有力的证据，证明SARS-CoV2感染需要全长膜结合的ACE2，同时也表明，在没有或存在膜结合的全长ACE2受体的情况下，可溶性ACE2缺乏作用。

        总之，我们在这里报告的研究结果表明，在研究的任何细胞模型中，低浓度应用可溶性ACE2时，不会促进SARS-CoV-2传染性的显著增加。重要的是，在缺乏膜结合的全长ACE2的情况下，类肾器官不能被SARS-CoV-2感染。此外，在使用ACE2突变动物的小鼠中建立了一个SARS-CoV-2严重感染的可靠模型，支持了本文报道的ACE2作为SARS-CoV2受体的重要性的证据(Gawish等，2022年)。基于我们的发现，包括使用ACE2缺乏性肾脏类器官模型来减少实验偏差，我们得出结论，全长膜结合的ACE2是SARS-CoV-2传染性的基本决定因素，低水平的可溶性ACE2蛋白可能与体内的水平大致一致，不能促进传染性。

Yeung的回复

        Batle等人(2022年)的信中报告称，使用超生理浓度(20-200 mg/mL)的类器官模型使用rACE2治疗SARS-CoV-2感染可以被抑制。同时，使用我们之前报道的HK-2细胞模型，在生理浓度(0.1-100 ng/mL)下使用rACE2处理后，没有观察到明显的变化(增强或抑制)(Yeung等人，2021年)

        我们很遗憾地看到，尽管使用了我们通过《细胞》(方法S1)编辑提供的实验条件，但Batle等人(2022)未能从他们的数据(图S1A, Battle等人，2022)中得出与我们在之前的研究中相同的结论。以下是两项研究在实验条件上的关键差异，这可能导致了差异。

        使用不同形式的ACE2。batle等人(2022)使用了一种工程二聚体形式的ACE2 (APN01)，而不是我们在之前的研究中使用的原生sACE2 (Yeung等人，2021)。根据US8586319专利(由信中一些作者共同拥有)，二聚体rACE2形式经历了严格的优化表达结构(使ACE2所有可能的n-糖基化位点成为可能)、表达宿主(产生至少10 pg/细胞/天的rACE2)和培养基(额外添加Zn2+离子以产生含锌的ACE2二聚体)的处理。据报道，与单体形式相比，由此产生的rACE2二聚体(APN01)具有更好的溶解度、生物利用度和酶活性。尽管APN01可能代表了用于治疗的rACE2的改良形式，但它不适合测试原生sACE2的生物活性。尽管rACE2形式不同，但我们注意到，需要rACE2的超生理浓度(20-200 mg/mL)来抑制肺和肾衍生类器官中的SARS-CoV-2感染(图s1 - s1e, batle等人，2022年)。在患者中给如此高水平的rACE2药物是非常困难的。APEIRON Biologics报道的rACE2在恒河猴、仔猪和BALB/c小鼠静脉注射后的药效学结果支持了这一结论。尽管作者使用了APN01，其体内稳定性高于其自然存在的形式(图20在专利US8586319中)，但在给药后不久，从猕猴和仔猪提取的血清样本中只检测到~2 ug/mL的rACE2(即，毫克水平的rACE2，取决于动物种类)(图7在专利US8586319中)。这些动物体内rACE2的初始血清浓度已经比类器官抑制SARS-CoV-2所需的报告剂量低约10 - 100倍(batle等人，2022年的图S1B、S1C和S1F)。此外，考虑到rACE2的半衰期，很难长时间保持高浓度。此外，我们此前还表明，低剂量的rACE2可增加SARS-CoV-2的传染性(图6A、6B和S3, Yeung等人，2021年)。因此，由于rACE2会随着时间的推移而降解，它可能会降低到促进而不是抑制SARS-CoV-2进入细胞的水平。

        数据处理。我们注意到，使用HK-2细胞收集的数据点的变化比使用类器官收集的数据点大得多，尽管处理类器官培养在技术上比处理HK-2细胞培养要求更高(图S1A, batle等人，2022年)。例如，在1 ng/mL的治疗组，最高数据点>比最低数据点高60倍。这引起了人们对实验的可重复性的关注，因此也引起了人们对实验结论的担忧。进一步优化实验条件，使用原生sACE2，多次重复实验可以改善实验结果。此外，battle等人在“模拟感染细胞的折叠变化”中提出了他们的数据，该数据不允许对传染性进行评估。由于在任何治疗组中均未观察到明显变化，显示MOI/TCID50的数据表示应该更有助于评估感染效率。

        在类器官建立过程中，含有不确定因素的成分/补充物可能会影响感染研究的结果。例如，我们注意到作者使用mTeSR培养基来建立肺类器官。根据产品信息，mTeSR培养基含有FGF2，可影响冠状病毒感染(Yeung et al.， 2016)。其他细胞因子，如TNF-a，可诱导ACE2脱落，从而促进病毒进入(Haga等人，2008;Lambert et al.， 2005)，通常用于类器官分化。在类器官成熟过程中包含这些因子可能会潜在地改变sACE2的基础水平。此外，类器官中sACE2的基础水平可能足够，掩盖了sACE2对SARS-CoV-2传染性的影响。这也可以解释batle等人使用类器官获得的数据与使用细胞模型获得的数据之间的差异(图S1, batle等人，2022年)。因此，在类器官中，在评估sACE2对SARS-CoV-2感染的真实作用时，应测量sACE2的基础水平。

        开发类器官模型的目的是为研究细胞反应(包括感染和药物治疗)提供一个替代平台，这些反应更接近生理条件。尽管如此，巴特尔等人的研究结果表明，只有从rACE2的超生理浓度(20-200 mg/mL)开始的治疗才能观察到感染抑制(巴特尔等人，2022年的图S1B、S1C和S1F)。然而，这种浓度已被证明在体内和临床试验研究(如上所述)中实际上是无法达到的。应用类器官模型研究感染的另一个挑战是相关的细胞异质性，因为一个器官中只有有限的细胞类型易受SARS-CoV-2感染。这些易感细胞类型通常代表一个器官内的少数群体。因此，纳入非敏感细胞类型可能为研究sACE2对SARS-CoV-2传染性的影响带来额外的挑战。相比之下，同种细胞培养，如HK-2细胞，可以完全控制感染环境。该细胞系为SARS-CoV-2研究提供了另一种模型，有助于研究rACE2的生理相关水平及其对SARS-CoV-2感染的影响。