【原】集美大学陈晓梅Anal. Chem.：基于RPA的光电化学分析用于多种病原体的便携式检测！

 1

研究内容

便携式、超灵敏、同时定量检测多种食源性病原体的核酸对公共卫生至关重要。然而，目前的测试方法依赖于昂贵的设备和繁琐的放大步骤。

集美大学陈晓梅教授提出了一种光电化学（PEC）生物传感器，结合重组酶聚合酶扩增（RPA）技术（RPA-PEC），用于在980 nm光照射下快速检测多种食源性病原体。通过RPA在相应的电极表面启动大肠杆菌O157:H7和金黄色葡萄球菌的基因组DNA，从而形成纸上实验室平台。使用形成的DNA-PEC信号器，仅在RPA 20分钟后，就在37°C下获得了光电流。该检测性能优于常规琼脂糖凝胶电泳，对大肠杆菌O157:H7和金黄色葡萄球菌的检测限分别为3.0和7.0 copies/μL。相关工作以“A Collection of RPA-Based Photoelectrochemical Assays for the Portable Detection of Multiple Pathogens”为题发表在国际著名期刊Analytical Chemistry上。

 2

研究要点

要点1. 作者在自制的三维丝网印刷纸基电极上设计了两个工作表面。将溶液前向引物-1（AF₁）固定在Au NP功能化的丝网印刷纸基电极（SPPEG）表面上。重组酶与三个引物（Bi₂S₃连接反向引物-1（AR₁）、电极固定化的AF₁和溶质AF₁）结合形成复合物，在基因组DNA（gDNA）模板中寻找靶位点。在复合物定位在模板上后，启动链交换反应，其中DNA片段在升高的位点被替换。SSB与移位的DNA链结合，形成稳定的D环结构并防止DNA重组。重组酶解离后，引物的3′端暴露并被DNA聚合酶识别，其中根据模板序列将引物添加到相应的碱基中。然后同时启动液相和固相扩增，聚合酶继续解开模板的双链结构，同时延伸引物，DNA合成继续。随后，将前一阶段的产物用作下一阶段的DNA模板，以引发RPA。最后，将含有Bi₂S₃的扩增子固定在SPPEG上，并且随着更多Bi₂S₃被固定，PEC信号逐渐增强。

要点2. 为了实现对多种病原体的同时检测，设计了双通道电极。特别是，在具有共用的对电极和参比电极的不同工作电极上检测到大肠杆菌O157:H7和金黄色葡萄球菌。使用SPPEG作为大肠杆菌O157:H7检测的工作电极，而使用Cu₂O工作电极进行金黄色葡萄球菌检测。

要点3. 形成的DNA-PEC信号器，仅在RPA 20分钟后，就在37°C下获得了光电流。该检测性能优于常规琼脂糖凝胶电泳，对大肠杆菌O157:H7和金黄色葡萄球菌的检测限分别为3.0和7.0 copies/μL。

该研究开创了一种新的食源性病原体RPA-PEC方法，并为构建便携式检测多种核酸的纸上实验室平台提供了方向。

 3

研究图文

图1.（A）SPPE、（B）SPPEG和（D）Cu₂O纳米立方体的SEM；（C）Bi₂S₃纳米棒的TEM（插图：Bi₂S₃纳米棒的放大图）；（E）Bi₂S₃纳米棒和（F）Cu₂O纳米立方体的XRD。

图2.（A）紫外-可见吸收光谱。（B）琼脂凝胶电泳（2%）2 μL Bi₂S₃-AR₁（泳道1）、4 μL Bi₂S₃-AR₁（泳道2）、8 μL Bi₂S₃-AR₁（泳道3），洗涤Bi₂S₃-AR₁后第一次（泳道4）、第二次（泳道5）和第三次（泳道6）的剩余溶液，不含Bi2S3的RPA（泳道7）的琼脂糖凝胶电泳（2%）。条件优化：（C）SH-AF₁修饰的浓度和（D）孵育时间，以及（E）溶质AF1的浓度。（F）SPPEG（a）、AF₁-SPPEG（b）、RPA-SPPEG（c）和Bi₂S₃-RPA-SPEG（d）的Nyquist图。O157:H7大肠杆菌的初始浓度为1.0×10⁴ copies/μL。误差条表示三次重复的标准偏差。

图3.（A）在25、37和60°C下使用单个和多个RPA的琼脂凝胶电泳（2%），扩增产物可以通过大小进行鉴定：大肠杆菌O157:H7为350 bp，金黄色葡萄球菌为165 bp。（B）Bi₂S₃纳米棒和Cu₂O纳米立方体在不同偏置电势的PEC响应（插图：Bi₂S₃和Cu₂O的偏置电势的优化）。（C）（a）RPASPPEG，（b）Bi₂S₃-RPA-SPPEG（1.0×10⁶ copies/μL大肠杆菌O157:H7初始gDNA）和（c）Bi₂S₃-RPA-SPEG（1.0×10² copies/μL大肠杆菌O157/H7初始gDNA）的PEC反应。（D）（a）Cu₂O-SPPE，（b）RPA-Cu₂O-SPPE（1.0×10² copies/μL金黄色葡萄球菌初始gDNA）和（c）RPA-Cu₂O-SPPE（1.0×10⁶ copies/μL金色葡萄球菌初始gDNA）和（D）SPPE的PEC反应。

图4.（A）RPA-PEC生物传感器在不同gDNA copies数（0、1.0、1.0×10¹、1.0×10²、1.0×10³、1.0×10⁴、1.0×10⁵、1.0×10⁶、1.0×10⁷、1.0×10⁸、1.0×10⁹和1.0×10¹⁰ copies/μL）下对大肠杆菌O157:H7检测的灵敏度。（B）在20分钟时获得的校准曲线取决于gDNA拷贝数。（C）20分钟后的RPA的DNA凝胶和（D）其相对强度值。误差条表示三次重复的标准偏差。

 4

文献详情

A Collection of RPA-Based Photoelectrochemical Assays for the Portable Detection of Multiple Pathogens

Rui Ge, Hanjie Dai, Shumin Zhang, Jie Wei, Tianhui Jiao, Qingmin Chen, Quansheng Chen, Xiaomei Chen*

Anal. Chem.

DOI: 10.1021/acs.analchem.3c01006