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题目：Natural Allelic Variation in GRAIN SIZE AND WEIGHT 3 of Wild Rice Regulates the Grain Size and Weight 刊名：Plant Physiology 作者：Xiangdong Liu, Lan Wang et al. 单位：Hebei Agricultural University, Baoding 日期：30 May 2023    01 摘要  籽粒大小对水稻产量有重要影响。虽然已经分离出许多与粒级相关的基因，但由于它们之间的相互作用和表型效应，很少能用于育种。在这里，我们描述了位于野生水稻(Oryza rufipogon Griff.) 3号染色体上的颗粒型数量性状基因座GRAIN SIZE AND WEIGHT 3 (GSW3)的自然变异，该基因座编码一个gtp酶调节蛋白，该蛋白可以负调控粒长、粒宽和千粒重。 在野生稻中插入一个232 bp的基因组序列片段，一个天然等位变异基因(GSW3)，提高了表达水平，降低了粒长、粒宽和千粒重。在野生自交系花叶3号中敲除GSW3后，籽粒长、宽和千粒重均增加。 将GSW3 huaye3导入栽培水稻KJ01中，在华叶3号中过表达GSW3 huaye3，籽粒长、宽和千粒重均降低，且籽粒大小和千粒重的变化与GSW3表达水平密切相关。GSW3通过促进粒颖片细胞分裂和细胞纵向和横向生长，同时调节粒长和粒宽。GSW3还参与调控赤霉素信号通路，负调控植物生长。 此外，GSW3编码区的一个关键SNP与栽培水稻的粒级变异显著相关。该SNP导致GSW3第161位的氨基酸由Gln替换为Arg，从而减小了颗粒大小。我们的研究表明，GSW3负调控粒形，这可以解释现代品种和野生水稻的粒形差异。GSW3还可用于培育粒型优良、产量较高的水稻品种。 02 技术路线  wild rice (Oryza rufipogon Griff.) inbred line, Huaye 3 Agronomic trait analysis Phylogenetic analysis Vector construction and plant transformation RNA extraction and RT-qPCR analysis、RNA-seq analysis GUS Assay、Subcellular localization、Yeast two-hybrid screening Rice glume plastic semithin slices、Gibberellin treatment Scanning electron microscopy observation of rice glumes、Haplotype analysis across the GSW3 coding region 03 主要结果 3.1 水稻G蛋白系统发育分析及亲本间GSW3基因序列分析 据报道，RGA1、RGB1、RGG1、RGG2、GS3、qPE9-1/DEP1和GGC2等G蛋白可以调节水稻的颗粒形状。GSW3编码gtp酶调节蛋白，但没有典型的g蛋白结构域。由GSW3全长蛋白序列和7个带有MEGA7的G蛋白构建了一个未生根的系统发生树(图1A)。将8个基因分为2个不同的组，其中GSW3和RGA1属于同一进化枝。推测GSW3与RGA1具有相同的功能。 根据我们前期工作的连锁分析，PSM379 - RID24455区间对表型的贡献达到54.85% ，我们推测该区域有多个基因调控粒长。因此，我们使用CRISPR/Cas9技术对GSW3进行了功能研究。将亲代华叶3与KJ01的GSW3基因编码序列进行比较，共产生12个SNPs;其中7个SNPs差异导致氨基酸置换(表S1)。 华叶3的GSW3在289位有一个232 bp的插入，直接导致氨基酸翻译提前终止(图1B)。在Huaye3和KJ01之间的GSW3启动子区域在起始密码子上游1000 bp范围内也产生了20个SNPs(表S2)。 3.2 GSW3的表达模式 为探究GSW3在KJ01和华叶3号的时空表达差异，分别提取同期华叶3号和KJ01的根、茎、叶和穗的RNA，采用RT-qPCR检测GSW3的表达。结果表明，GSW3在华叶3号和KJ01的根、茎、叶和穗等所有组织中均为组成型表达基因。花叶3号各组织中GSW3的表达水平均高于KJ01，且在根部和穗部的表达水平较高(图1C)。随着幼穗的发育，花叶3号小穗的GSW3表达水平逐渐降低(图1D)。花叶3籽粒发育过程中，GSW3的mRNA表达水平在花后3 ~ 7 d逐渐升高，花后10 d下降，花后15 ~ 25 d逐渐升高(图1E)。 为了进一步研究GSW3的表达模式，我们使用β-半乳糖苷酶(GUS)检测了GSW3启动子在日本裸背景下的活性。我们检测了根、茎、叶和穗中的GUS活性，这与我们的RT-qPCR结果一致(图1F)。年轻穗的GUS活性高于年老穗。
3.3 GSW3编码一种核蛋白 构建pBin19-eGFP-GSW3载体，通过浸润烟草叶表皮观察GSW3蛋白的定位。表皮细胞瞬时表达结果显示，GSW3定位于细胞核内(图2A)。此外，我们还构建了由35S启动子驱动的pOX-GFP-GSW3和PAN580-mKATE融合基因。两个融合体一起转移到水稻原生质体中，我们观察到pOX-GFP-GSW3融合蛋白定位在水稻原生质体的细胞核中(图2B)。这些结果与本氏烟叶表皮侵染实验的结果相似。
3.4 GSW3负向调控晶粒尺寸 为了研究GSW3的分子功能，我们首先使用CRISPR/Cas9基因编辑技术在华叶3背景下敲除GSW3。共获得19株转化植株，其中5株(命名为1、2、3、4和5)产生了籽粒大小、穗形和株高等表型变异。然后，将5个表型变异植株培育成T1株系，每个株系包含50个个体。在T1系中，这些变异性状保持稳定遗传。与野生型花叶3号相比，5个表型可变株(#1~#5)的T1系株高、穗长、粒长、粒宽均显著增加(表S3)。然后，对来自5个表型变异植株的GSW3的两个靶点进行测序并检查缺失靶点。令人惊讶的是，第3、4和5行似乎没有达到目标。 GSW3在#1和#2的两个目标区域有5种编辑类型，这5种编辑类型被命名为KO-1、KO-2、KO-3、KO-4和KO-5(图3A)。这些编辑类型均为碱基插入或缺失突变，导致氨基酸发生移码突变。与野生型华叶3相比，KO突变体在不同编辑类型下的颗粒长度和宽度显著增加(图3B, 3C)。 在转基因系的T2代(每个系50个个体)中，我们进一步分析了两种KO-1无T- dna且无靶点缺失的突变型(图3D)，即第一个靶点插入1-nt (G)，第二个靶点缺失2-nt (TT)，以及第一个靶点插入1-nt (G)，第二个靶点缺失1-nt (T)的KO-2的经济特征。与华叶3号相比，KO-1和KO-2系的粒长分别增加了20.16%和14.05%，粒宽分别增加了6.7%和4.6%，千粒重分别增加了69.01%和52.64%(表1、图3E)。这些直接提高了KO-1和KO-2每株的产量，分别提高了167.67%和38.07%(表1，图3F)。与野生型华叶3相比，KO-1和KO-2细胞系中GSW3的mRNA表达水平显著降低(图3G)。 再将华叶3号衍生的GSW3转化到KJ01中，获得功能互补的转基因株系。共获得21个转基因植株，其中4个植株的粒长和粒宽出现显著差异(表S4)，且粒长较野生型KJ01变短。将2株表型差异显著的功能性互补转基因植株(CF-1和CF-15)分别培育成T1和T2株系，每个株系包括50个个体。各种表型在gsw3华叶3号纯合突变体中保持稳定遗传，主要表现为粒长和粒宽减小(图3E)，株高略有缩短(图3H)。与野生型KJ 01相比，CF-1和CF-15细胞系中GSW3的mRNA表达水平也显著增加(图3H)。 为了进一步验证GSW3在水稻种子发育中的功能，我们在花叶3背景下过表达了GSW3花叶3。与野生型华叶3相比，16个转基因植株中有4个显示了非常显著的籽粒长度和宽度减少(表S5)。然后，对两个变异株(OE-6和OE-11)进行了进一步分析。在T1代(每个系包含50个个体)中，变异性状保持稳定遗传(图3E)，两个OE突变体中GSW3的mRNA表达水平相对于野生型华叶3增加(图3E)。这些数据表明GSW3是晶粒尺寸的负调控因子。
3.5 GSW3调控小穗壳的细胞分裂和细胞扩增 水稻籽粒大小主要受小穗壳的限制，小穗壳受籽粒细胞增殖和细胞扩张的调控。为了从细胞学角度解释GSW3 KO-2突变体中颗粒大小变化的原因，我们在显微镜下观察了GSW3 KO-2突变体中小穗中央部分的横切面(图4A)。KO-2突变体的平均单细胞面积明显增加，横断面的细胞数量低于华叶3(图4B)。 此外，通过扫描电镜(SEM)观察了花叶3号、KO (KO-1和KO-2)和OE (OE-6和OE-15)突变株成熟穗的外表皮细胞(图4C)。扫描电镜分析显示，与华叶3号相比，外表皮细胞的长度、纵向数量、宽度和横向数量均发生了显著变化。在GSW3 KO突变株中，外表皮细胞变长变窄，外表皮细胞数量沿纵轴减少，沿横轴增加(图4D)。 在GSW3 OE突变株中，外表皮细胞变短变窄，外表皮细胞数量沿纵轴和横轴增加(图4D)。这些结果与塑性半薄切片的结果一致。综上所述，GSW3通过影响细胞增殖和细胞分裂来调控种子粒径。
3.6 GSW3的转录组分析 为了进一步探索GSW3对籽粒长度的调控机制，我们对华叶3号和KO-2号不同长度的小穗壳(小穗壳分别为全长小穗壳的25%和50%)进行了转录组测序分析(RNA-seq)。在25%的全长颖片阶段有4,720个差异表达基因(DEGs)(表S6)。其中显著上调的基因有2479个，显著下调的基因有2241个。在50%的全长颖片阶段只有573个DEGs，其中344个DEGs上调，229个DEGs下调(表S7)。两个时期共有409个常见基因存在差异表达。 随着籽粒颖片的发育，DEGs的数量逐渐减少。转录组数据的数量足以满足接下来实验分析的必要质量水平(图5A, B)。由于颖片早期阶段的DEGs比后期阶段更多，我们进一步分析了25%全长颖片的DEGs。这些DEGs的基因本体(GO)术语显著富集于分子转运活性、信号转导活性、转录因子活性、蛋白结合等过程(图5C)。 我们还对DEGs的京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路进行了分析，表明许多基因富集在植物病原体相互作用、植物激素信号转导、淀粉和蔗糖代谢等方面(图5D)。这些活性与水稻颖片生长和胚乳发育密切相关。对DEGs的进一步分析揭示了几个已报道的调节籽粒形状和灌浆的基因，如RGG2、OsMADS1、SDT、OsGS1、GS5和OsRac1, RT-qPCR分析验证了这些基因的差异表达(图5E)。综上所述，在水稻生长和胚乳发育过程中，GSW3可以通过调控与籽粒形状和籽粒灌浆速率相关的基因转录水平来调控水稻籽粒形状。
3.7GSW3在赤霉素途径中起负调控作用 多种植物激素被报道参与控制种子发育和植物生长。在本研究中，与野生型华叶3号相比，KO突变体株高增加。为了探究GSW3是否参与赤霉素(gibberellin acid, GA)信号通路，我们通过测量GA3处理后的第二叶鞘长度，分析了华叶3、GSW3 KO-1和KO-2突变体对GA敏感性的差异(图6A)。在GA3处理前，将种子浸泡在5 μM多效唑中2 d以消除本底。在0.01 μM和1 μM外源GA3处理下，GSW3 KO-1和KO-2突变体植株第二叶鞘较华叶3显著伸长，但平均生长速率在0.01 μM下最高(图6B、C)，表明GSW3可以负调控对赤霉素的响应，0.01 μM是最适宜的处理浓度。 通过RT-qPCR检测0.01 μM外源GA3处理下GSW3 KO-2突变株中赤霉素生物合成和信号转导相关基因的表达水平。结果表明，GA阳性合成基因GA3ox2显著上调。相反，负性GA合成途径基因GA20ox1、GA20ox2、GA20ox3、GA2ox1、GA2ox3、KO2和KAO显著下调，GA信号转导基因GID2和SLR1也显著下调(图6D)。综上所述，这些信息表明GSW3介导了体内赤霉素的生物合成，并参与赤霉素信号通路来负调控植物生长。
3.8 通过酵母双杂交筛选物理相互作用蛋白 从RNA-seq数据中，构建了17个与籽粒大小、籽粒灌浆、GA信号通路相关的上调和下调基因，如GS3、OsMADS1、GS5、OsRac1等。通过酵母双杂交和点对点实验检测其与GSW3-AD蛋白的相互作用。然而，遗憾的是，没有发现相互作用的蛋白。 利用整个发育期和20 d的幼苗构建了两个酵母文库，筛选相互作用蛋白。在初步筛选中，发现了200多个基因。在加入3- AT(3-氨基-1,2,4-三唑)的培养基上进一步筛选，PCR鉴定，筛选出44个基因(图S1)。最终通过测序筛选出5个基因，分别为Os10g0577700、Os03g0265600、Os04g0445200、Os01g0282800、Os05g0108800(表S8)。其中，Os03g0265600和Os01g0282800在RNA-seq数据中分别在50%的全长颖片阶段上调和下调。Os01g0282800 (OsTUB1)编码一种具有gtp酶结构域的微管蛋白家族蛋白。 在之前的报道中，OsTUB1参与了谷物发育。OsTUB1在Nipponbare背景下过表达并增加颗粒大小。在GSW3的编码区，在KJ01和Huaye3之间共产生了12个SNPs。其中7个snp导致氨基酸置换(表S1)。为了研究GSW3编码区SNPs对水稻粒径和重量的可能影响，我们对2013年水稻基因组计划中的1025份栽培水稻种质进行了序列分析(https://www。rmbreeding。cn。索引/)。以Nipponbare序列为参考基因组，在GSW3编码区发现7个非同义snp。利用这些snp，可将种质分为5个单倍型。在籼稻种质中发现了4种单倍型(Hap1、Hap2、Hap3和ha4)，在其他种质中只发现了1种;其中，Hap1在粳稻品种中，Admix和Bas中，ha5在Aus中;然而，拥有648份粳稻品种的Hap1远远高于其他单倍型(图7A)。KJ01的GSW3可变碱基为Hap1，华叶3的GSW3可变碱基为Hap2。GSW3与Hap2相比，仅在开放阅读框上的一个SNP差异导致Hap3、ha4和ha5的颗粒大小和重量发生显著变化。Hap3、Hap4和Hap5的SNP导致了籽粒长度和重量的显著变异，Hap3和Hap5的SNP导致了籽粒长宽比的显著变异。Hap4的SNP导致了晶粒宽度的显著变化(图7B)。ha4的简并碱基R (A/G)(+80)编码Lys26/Arg26, Hap2的简并碱基C编码Thr26。ha5的G碱基(+161)编码Arg53, Hap2的A碱基编码Gln53。Hap3中简并碱基Y (C/T)(+373)编码Ala125/Val125, Hap2中简并碱基G编码Gly125。携带Hap4的品种籽粒长度和宽度增加，而携带Hap5的品种籽粒长度明显缩短。与Hap2 (Huaye3)相比，Hap5存在SNP差异，置换碱基G(+161)与GSW3-KJ01相同。该SNP导致GSW3第161位的氨基酸由Gln替换为Arg，导致GSW3的gtp酶活性降低，从而缩短水稻籽粒长度。这些结果表明，KJ01和Huaye3之间的晶粒大小和千粒重调控受到GSW3第161位非同义SNP的影响
 04 结论 GSW3是一个与qGL3.5紧密连锁的基因，调控水稻的粒长、粒宽和粒重。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在Huaye3背景下敲除GSW3，获得2个纯合突变体。GSW3基因敲除突变体的粒长、粒宽和千粒重均显著增加。 将来自Huaye3的GSW3诱导入KJ01或在华叶3号背景中过表达，颗粒明显变窄、变短。GSW3通过细胞增殖和分裂负调控晶粒大小。GSW3是位于细胞核内的组成性表达基因。GSW3在幼穗中表达量较高，随幼穗发育逐渐降低。GSW3参与GA信号通路，负向调控植物生长。 05 原文获取 原文链接： https:///10.1093/plphys/kiad320 原文获取： https://www./h-nd-212.html |
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