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生科云网址：https://www./ 编译：微科盟草重木雪，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。 微科盟原创微文，欢迎转发转载。 论文ID 实验设计
实验结果 扩增子序列变体(ASV)水平Sobs指数的稀疏曲线表明，随着随机选择的测序数量的增加，各组的物种多样性逐渐达到稳定。这些结果表明，实验测序数据量是合理的，实验结果是高度可靠的（图1A）。我们基于ASV集合的构建对样本进行多样性分析（图1C，D）。MC（P<0.05）、MLRS（P<0.05），HLRS（P<0.01）和阳性药（PC）（P<0.05）组的Ace指数显著低于NC组，并且Shannon指数也显著低于NC（P<0.05）。基于属丰度的PCoA显示，肠道微生物组成对HFD和LRS干预表现出明显的反应（图1B）。尽管PC组的聚集性接近MC组，但这两组仍有明显的分离。然而，MC组的肠道微生物组成与LRS组和NC组完全分离，这表明与MC组相比，不同剂量的LRS补充诱导了更显著的肠道微生物结构变化。这些发现与Duan等人的研究一致，该研究侧重于HFD与微生物群之间的关系。研究表明，HFD可以减少有益细菌（拟杆菌和乳杆菌）的丰度，增加有害细菌（弯曲杆菌、脱硫弧菌和梭菌）的数量，从而改变肠道菌群的结构。作为潜在的益生元，LRS可以促进有益细菌（双歧杆菌和乳杆菌）的增殖，并增加短链脂肪酸的产生。因此，我们有必要进一步研究各组肠道微生物组成的差异。
为了确定门与属之间的特定肠道微生物类群，这些分类群解释了与不同饮食干预措施相关的最显著差异，我们使用LEfSe分析分析了微生物群落。如图2所示，我们在六个类群中发现了81个丰富的差异分类群，包括34个属。NC组在属水平上以乳杆菌、Monoglobus、芽孢杆菌、肠杆菌、瘤胃球菌等为主。相比之下，MC群的特征是unclassified_f_Atopoblaceae和Parasutterella。相关研究还证实，Parasutterella与肠易激综合征和肠道慢性炎症有关，与肥胖和2型糖尿病呈正相关。因此，这些细菌的变化可能表明HFD诱导的疾病的发病机制。PC组主要为Allobaculum、Limnohabitans和Parvibacter。LLRS组以Alistipes、Odoribacter、Anaerotruncus、Jeotgalicoccus等为主，MLRS组以norank_f_Muribaculaceae、norank_f_Erysipelotrichceae、Methylcycstis和CL500_29_marine_group为主，而HLRS组在属水平上以Faecalibaculum为主。研究表明，norank_f_Muribaculaceae和norank_f_Erysipelotrichceae可能与抗肥胖有关，Allobaculum可能参与调节HFD小鼠的肠道ANGPTLT4表达。因此，这些细菌可以成为改善HFD诱导的高脂血症的肠道指标。我们将进一步分析这些属在肠道微生物群落中的组成。
我们测定不同分类单元水平的细菌丰度，以研究不同剂量LRS干预对肠道微生物结构的改变。如图3A和B所示，所有组都具有六个优势门（厚壁菌门、拟杆菌门、脱硫菌门、放线菌门、Campilobacterota和Deferribacterota），但相对丰度不同。从图中可以看出，MC组的厚壁菌门高于NC组，而拟杆菌门低于NC组，而补充LRS可逆转这些变化（图3A、B）。这一结果与Duan等人的研究基本一致，Duan等人在给小鼠喂食HFD后，使用全谷物燕麦来降低厚壁菌门/拟杆菌门的水平。因此，我们认为补充LRS可能会影响HFD小鼠的肠道厚壁菌门/拟杆菌门比率（LLRS
0.73，MLRS 0.57，HLRS 0.95）。相关研究表明，厚壁菌门和拟杆菌门与糖脂代谢和胆汁酸代谢密切相关，它们的比例（厚壁菌/拟杆菌，F/B）已成为决定肥胖的指标之一。F/B比率越高，肠道越容易吸收能量，而F/B比率愈低，肠道吸收能量越慢，从而有助于降低脂质。根据我们的发现，与LLRS和HLRS组相比，MLRS组厚壁菌门的丰度最低，拟杆菌门的丰度最高，F/B比率也最低，表明在不同剂量组中，中剂量LRS在降低F/B比率方面效果最好，对肠道能量的影响最为显著。因此，MLRS可能具有更好的降血脂效果。
细菌类型的属水平组成如图3C所示，均为总丰度比>0.01的细菌类型。norank_f_Muribaculaceae、Allobaculum、Faecalibaculum、norank_f_Desulfovibrionaceae和norank_f_Eubacterium_coprostanoligenes_group在属水平上占总物种的大多数，约占各组微生物的30%-80%，属于属水平上的优势菌群。与NC组相比，MC组具有更高的Allobaculum丰度和更低的norank_f_Muribaculaceae丰度（图3C，D）。然而，与MC组相比，LRS显著恢复了这些菌的丰度。值得注意的是，与LLRS和HLRS组相比，MLRS组的Allobaculum丰度最低，norank_f_Muribaculaceae丰度最高（图3D）。Cao等人发现，对HFD诱导的肥胖具有抗性的小鼠肠道菌群中Muribaculaceae的比例高于其他小鼠。此外，在门和属水平上，LRS对高脂血症小鼠微生物群组成的影响与PC组不同，这可能与LRS改善高脂血症的机制有关。因此，我们的研究结果表明，LRS可以显著改变HFD引起的肠道微生物结构，中等剂量的LRS补充可能有助于提高小鼠的肥胖抵抗力。
基于Wilcoxon秩和检验，我们在属水平上分析了各组和MC组前10个丰富细菌类型之间组成差异（图4）。与NC组相比，MC组中Allobaculum（P<0.05）、Faecalibaculum（P<0.05），norank_f_Eubacterium_coprostanoligenes_group（P<0.05）和Dubosiella（P<0.05）的丰度显著增加（图4A）。相关研究表明，HFD可以诱导Allobaculum丰度的增加，这与我们的研究结果一致。此外，He、Zhang等人报道，Faecalibaculum在肥胖小鼠中显著富集。MC组中这些细菌丰度显著高于NC组，表明肥胖相关细菌在高脂血症小鼠的结肠中增加，从而改变了肠道微生物群的稳态。PC组Faecalibaculum、双歧杆菌和Blautia的丰度显著低于MC组（图4E），这一结果与Zhang等人的研究相似。
与MC组相比，LLRS组Alistipes的丰度显著增加（P<0.05）（图4B）。与MC组相比，MLRS组的norank_f_Muribaculaceae和norank_f_Erysipelotrichaceae的丰度显著增加（P<0.05）（图4C）。在HLRS组中，肠杆菌的丰度显著降低（P<0.05）（图4D）。此外，所有LRS组中Allobaculum的丰度均显著降低（P<0.05）（图4B、C、D）。先前的研究表明，Allobaculum丰度的增加与肥胖有关，Alistipes是一种潜在的炎症调节菌。Li、Wang等人发现，熊去氧胆酸处理降低了喂食高脂肪、高胆固醇饮食的小鼠肠杆菌丰度。然而，Koistinen等人发现，通过全麦麸饮食可以增加HFD小鼠肠杆菌的丰度，这可能与不同的饮食处理引起的微生物群结构变化有关，不同的饮食处理会导致肠杆菌丰度变化的差异。此外，相关研究表明，补充豆类和豌豆可以通过促进norank_f_Muribaculaceae和norank_f_Erysipelotrichaceae的丰度来降低肥胖和血清胆固醇水平。这些结果表明，LRS可能在调节HFD引起的肠道微生物结构失衡中发挥积极作用，尤其是在MLRS组。
正（图5A）和负（图5B）离子电流图显示，在本实验的检测条件下，峰值形状是可接受的，分布相对均匀。我们对所有组的结肠内容物样本进行PLS-DA分析，选择95%置信区间，并通过Pareto转换进行数据转换。如图5C，D所示，NC组的样品与其他组分离，其余组的样品紧密聚集，表明NC组的肠道代谢产物组成与其他组有显著差异，而其他组的样品则紧密聚集，具有良好的组内重复性。因此，该方法是可靠的，结果是可靠的。
各组和MC组之间具有显著差异的代谢物数量之间的关系如图5E所示。差异代谢物的总数只有一个，而NC与MC、LLRS与MC、MLRS与MC，HLRS与MC和PC与MC之间的独特差异代谢物的数量分别为350、78、76、15和129个。实验组和模型组之间共享的差异代谢产物的数量为12（图5F），而LLRS vs MC特有135个，MLRS vs MC特有127个，HLRS vs MC特有66个。 双离子模式下差异代谢物的火山图如图6A–E所示。我们对水平和垂直坐标值进行了数值处理。水平坐标表示两组代谢产物表达差异的倍数变化值，即log2FC（FC:倍数变化），垂直坐标表示代谢产物表达差值的统计检验值，即-log10（P值）。在p＜0.05、VIP（变量投影重要性）＞1和FC＞1或＜1的条件下，我们检验了所有代谢产物并与KEGG数据库进行比较，总共确定了12种有机酸及其衍生物、33种胆汁酸及其衍生物和71种脂肪酸及其偶联物。我们根据上述三种标志性代谢产物（有机酸及其衍生物、胆汁酸及其衍生物和脂肪酸及其偶联物）分别构建各组的代谢谱，并比较两组之间代谢物的差异，对52种差异代谢产物进行评分。选择的52种差异代谢物如表1所示。胆汁酸、醇类和衍生物以及羧酸和衍生物主要属于KEGG分类（表1）。研究表明，胆汁酸衍生物、脂肪酸偶联物和羧酸化合物（乙酸和甲酸）可能有助于改善高脂血症。
此外，与NC组相比，MC组小鼠结肠中的甘氨熊去氧胆酸（GUDCA）、α-MCA和牛磺酸脱氧胆酸（TUDCA）的含量均上调（P<0.05）。我们的发现表明，HFD影响小鼠结肠中胆汁酸和脂肪酸的代谢。UDCA和α-MCA是由6β-羟化酶转化小鼠肝脏中的胆固醇形成的初级胆汁酸。因此，G/T-UDCA和α-MCA含量的增加也表明MC组的胆固醇含量较高。 与MC组相比，LLRS组小鼠结肠中胆酸（CA）和甲酸的含量上调，而α-MCA、熊去氧胆酸（UDCA）和脱氧胆酸（DCA）的含量下调（P<0.05）。CA在肝脏中由胆固醇转化而来，进入肠道后可被肠道微生物代谢为DCA。UDCA来源于肝脏中的6-羟化酶转化的鹅去氧胆酸（CDCA）或肠道中的微生物代谢的CDCA。相关研究表明，膳食纤维可以通过包裹次级胆汁酸（DCA或石胆酸（LCA））进行排泄，从而促进胆固醇分解代谢为初级胆汁酸，并起到降低血脂的作用。此外，甲酸作为一种短链脂肪酸，已被广泛证实与抗肥胖、缓解代谢综合征和肠道屏障有关。因此，LLRS的摄入可以促进高脂血症小鼠胆固醇的分解代谢和次生胆汁酸的排泄，从而影响脂质水平。
在MLRS组中，CA和Cerbronic
acid均显著增加，而GUDCA、α-MCA和20-羧基白三烯B4显著减少（P<0.05）。CA含量的增加可能与胆固醇分解代谢为CA有关。20-羧基白三烯B4（C20）是一种长链脂肪酸，被认为可以促进脂肪生成和脂滴形成。因此，补充MLRS不仅可以促进胆固醇分解和胆汁酸代谢，还可以抑制长链脂肪酸的产生，从而促进血脂的降低。 在HLRS组中，补充HLRS也促进了CA的增加以及UDCA和DCA的减少。此外，与MC组相比，HLRS组和PC组中3，4-Mmethyleneazelaic acid（C11）的相对量均显著增加，MC组己酸（C6）、壬二酸（C9）、3,4-Methyleneazelaic acid（C11）和（E）-10-Oxo-8-decenoic acid（C10）的相对含量与NC组相比显著降低。Liu等人发现，中链脂肪酸可以通过调节胆汁酸代谢来降低血清胆固醇，从而在改善高脂血症中发挥作用。先前的研究表明，单不饱和脂肪酸在肥胖和炎症中起着积极作用。在本研究中，HLRS和PC组中单不饱和脂肪酸（油酸、棕榈酸和硬脂酸）的相对含量显著降低。因此，HLRS还可以促进胆固醇分解代谢为CA，HLRS也可以通过促进中链脂肪酸的产生和抑制单不饱和脂肪酸的增加来发挥降血脂的作用。PC组的降低效果与HLRS组相似。 相关研究表明，RS的摄入可以改善肥胖，并在降脂中发挥作用，这可能与菌群调节的胆汁酸成分变化有关。Chen等人发现BA可以通过激活FXR和SREBP1c途径来调节脂肪生成并抑制超低密度脂蛋白（VLDL）的产生。总之，在我们的研究中，LLRS、MLRS和HLRS都可以通过促进胆固醇分解代谢为CA来影响脂质水平，但MLRS也可以抑制长链脂肪酸的产生，这可能与MLRS在改善高脂血症和降低脂质水平方面的最佳效果有关。 不同代谢产物的变化通过相应代谢途径的波动进一步反映出来。因此，我们接下来对NC、LRS和MC组之间的差异代谢物进行了KEGG富集分析，以确定哪些途径与差异代谢物有关（图7A–D）。NC组和MC组之间受不同代谢产物影响的途径（前5个）是α-亚麻酸代谢、次级胆汁酸生物合成、蛋白质消化和吸收、丙酸代谢和初级胆汁酸生物合成（图7A）。研究表明，脂肪酸代谢与α-亚麻酸代谢途径密切相关。Oliva等人还发现，α-亚麻酸与脂质代谢的改善有关，在本研究中，NC组和MC组之间的差异代谢产物也将其确定为一种富集途径。此外，HFD引起的脂肪堆积和肝脏脂肪变性与胆汁酸合成有关。补充NC和MC组的高脂血症小鼠的差异代谢产物也显示出初级胆汁酸合成途径和次级胆汁酸合成通路的显著富集。 LLRS和MC组之间受差异代谢产物影响的途径（前5个）是次级胆汁酸生物合成、丙酮酸代谢、初级胆汁酸生物合成、膦酸盐和亚膦酸盐代谢以及氮代谢（图7B）。在MLRS和MC组之间，受影响的代谢途径（前5个）包括次级胆汁酸生物合成、丙酮酸代谢、初级胆汁酸生物合成，膦酸盐和亚膦酸盐代谢以及氮代谢（图7C）。此外，相关研究表明，丙酮酸脱氢酶复合物的上调可以缓解HFD引起的肥胖。McCommis和Finck还发现，肝脏脂肪变性和纤维化可以通过调节丙酮酸代谢来治疗。LLRS、MLRS和MC组之间的差异代谢产物也显示出丙酮酸代谢途径的显著富集。 HLRS和MC组在次级胆汁酸生物合成、初级胆汁酸生物合成、寿命调节途径、脂肪酸生物合成以及角质、木栓质和蜡的生物合成中具有显著富集的不同代谢产物（图7D）。油酸和3,4-Mmethyleneazelaic acid等脂肪酸被认为与脂质代谢有关，这与本研究中HLRS和MC组之间的差异代谢产物在脂肪酸合成途径中显著富集的事实一致。 此外，次级胆汁酸通过肠道重新吸收或通过粪便排出，以减少肝脏中的胆固醇积聚，从而有助于预防和改善脂肪肝疾病。补充LLRS、MLRS、HLRS和MC组的高脂血症小鼠的差异代谢产物在初级胆汁酸合成途径和次级胆汁酸合成通路中也表现出显著富集。 接下来我们在属水平上对结肠差异代谢产物、差异菌群和血脂水平进行Pearson相关性分析（图8）。在转录组学方面，先前的研究表明，LRS对高脂血症小鼠具有一定程度的降脂作用。我们之前的研究已经证实补充LRS可以降低甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL-C）和低密度脂蛋白（LDL-C）。此外，本研究发现肠道微生物群及其代谢产物与高脂血症有关。因此，我们使用Cytoscape
V3.7.1构建了肠道微生物群-代谢物-血脂指数的相关网络图（图8）。 LLRS小鼠结肠中Alistipes丰度的增加与甲酸呈正相关。甲酸与血清TC、LDL-C和HDL-C呈负相关（P<0.05）。HLRS小鼠结肠中Parasuttevella丰度的降低与3,4-Mmethyleneazelaic acid呈负相关，3,4-Mmethyleneazelaic
acid与血清TC、LDL-C和HDL-C呈负相关（P<0.05）。HLRS小鼠结肠中肠杆菌丰度的降低与油酸呈正相关，而油酸与TG和HDL-C呈正相关（P<0.05）。中链脂肪酸(3,4 -Mmethyleneazelaic acid)已被证明可以通过降低血清胆固醇来改善高脂血症，而油酸被认为与脂质沉积和脂质产生有关。在MLRS组中，norank_f_Muribaculaceae丰度的增加与CA呈正相关。CA与血清TG、TC和LDL-C呈负相关（P<0.05）。相关研究证实，CA是由胆固醇分解代谢形成的，因此CA的产生有利于胆固醇的分解代谢，从而起到降低血脂的作用。此外，补充LLRS、MLRS和HLRS可降低小鼠结肠中Allobaculum的水平，Allobaculum与20-羧基白三烯B4（C20）和油酸（C18）呈正相关。这些代谢产物与TG、TC、LDL-C和HDL-C呈正相关（P<0.05）。研究表明，长链脂肪酸可以影响脂肪生成和脂滴的形成。此外，Allobaculum在HFD小鼠肠道中的丰度已被证明显著增加。这些结果表明，不同剂量的LRS可以抑制Allobaculum的增殖，减少DCA、20-羧基白三烯B4和油酸的分泌，从而降低TG、TC、LDL-C和HDL-C的水平。此外，LLRS还可以通过促进Alistipes的增殖、分泌甲酸和降低TC、LDL-C和HDL-C水平来改善小鼠的高脂血症。MLRS还可以通过增加norank_f_Muribaculaceae的丰度、分泌CA以及降低TG、TC、LDL-C和HDL-C的水平来改善小鼠的高脂血症。而HLRS还可以通过抑制Parasuttevella和肠杆菌的增殖，促进3，4-Mmethyleneazelaic acid和减少油酸分泌，以及降低TC、HDL-C、TG和LDL-C水平来改善小鼠的高脂血症。
总之，本文旨在研究不同剂量的LRS补充对HFD诱导的高脂血症小鼠肠道微生物群和代谢产物的影响，并进一步构建“肠道微生物群-代谢产物-血脂指数”轴。我们的数据表明，摄入不同剂量的LRS可以调节肠道微生物群及其代谢，并提高血脂水平。此外，摄入LLRS、MLRS和HLRS可以抑制Allobaculum的增殖，从而减少代谢产物DCA、20-羧基白三烯B4和油酸的产生，这些代谢产物的减少也可以抑制TG、TC、LDL-C和HDL-C的水平（图9）。此外，LLRS还可以促进Alistipes的增殖，增加代谢产物甲酸的分泌，从而降低血脂水平。MLRS通过促进norank_f_Muribaculaceae的生长，刺激胆固醇分解为CA，从而降低TG、TC和LDL-C的水平。此外，HLRS通过抑制Parasutterrlla和肠杆菌的增殖，促进代谢产物3，4-Mmethyleneazelaic acid的分泌和抑制油酸的分泌，降低TC、TG、LDL-C和HDL-C水平。根据我们团队先前的研究，淀粉的结构与肠道微生物群的增殖有关。粗糙的淀粉颗粒表面形态可以保护肠道有益细菌免受酸等代谢产物的破坏，从而促进一些肠道有益细菌的增殖。因此，本实验制备的LRS是一种具有粗糙颗粒表观形态的3型抗性淀粉，这为本实验中优势菌群的增殖提供了有利条件。 结论 因此，结合我们之前的研究结果，我们发现中剂量LRS补充对高脂血症小鼠的脂肪肝病变和血脂异常的效果最好，这可能与促进norank_f_Muribaculaceae生长和抑制Allobaculum增殖有关，从而促进胆固醇分解为CA并抑制长链脂肪酸的产生。然而，本研究中不同剂量LRS之间肠道微生物群和代谢产物的差异，以及不同代谢产物和微生物在高脂血症小鼠中的调节机制，还有待进一步研究和验证。尽管仍需要进一步的研究来实施对潜在机制的研究，但综合来看，我们的研究结果突出了LRS作为一种有用的天然活性健康食品对预防和保护高脂血症的潜在益处。
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