【原】谈“污”色变！如何应对测序中常见污染

微生物群落研究正在彻底改变人类对微生物学的理解，但是微生物污染的DNA存在于各种操作中包含从取样到测序结束。其中常用的DNA提取试剂盒和其他实验室试剂中也存在污染，其严重影响从微生物量较低的样品中获得的结果。

DNA污染的可能来源包括分子生物学级水、PCR试剂和DNA提取试剂盒本身。对阴性对照进行了常规测序，包括“空白”DNA提取和随后的PCR扩增。在DNA提取步骤中不添加样品模板，这些阴性对照样品通常会产生一系列污染的细菌物种，这在与相同批次的DNA提取试剂盒同时处理的人源样品中也经常可见。

表1 阴性“空白”对照中检测到的污染物属列表

        结果显示所有位置之间存在一些相似的分类分类，包括Acidobacteria Gp2、Burkholderia、Mesorhizobium、Pseudomonas（图1）。这说明实验室之间的污染物含量存在差异，这可能是由于试剂、试剂盒批次之间的差异或实验室环境引入的污染物。

图1 稀释的纯培养物和对照的 16S rDNA 基因测序分类

来看个具体案例~

案例 -

污染提取试剂盒对低生物量群体研究的影响

通过鼻咽拭子来检查婴儿鼻咽微生物群的发育，主坐标分析（PCoA）显示了两个不同的类群，1-6个月的样本与后续时间的样本明显可以区分开，证明鼻咽菌群与发育时间有相关性（图2a）。但是使用四批试剂盒提取样品，样品的群落特征取决于使用哪种试剂盒进行DNA提取（图2b，d，e），并且前两个试剂盒的相关OTU构成了样品reads的大部分（图 2d）。

图2 鼻咽样本污染物含量总结

提取试剂盒和实验室试剂中的细菌DNA污染会显著影响微生物群研究的结果，特别是在研究含有低微生物生物量的样本。这样的污染对于16S rDNA项目和宏基因组项目都需要特别关注，以减少污染。

建议

开展同一项目时最好使用同一批次的试剂盒，以避免由试剂盒引入的污染。

无独有偶~“红皇后学术”公众号中，近期也针对“污染”这个话题进行了讨论，可详见《Nature观点文章｜胎儿微生物组研究中的疑问揭示了低生物量微生物研究的缺陷》。

凌恩生物全面升级的PacBio平台可满足16S rDNA全长研究需要，同时兼具时间短，无需扩增等优势，伴随着三代测序成本的下降，势必成为取代二代测序，提升研究品质的不二之选。

参考文献

Salter SJ,Cox MJ,Turek EM, et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 2014;12:87. doi:10.1186/s12915-014-0087-z