肺真菌病的精准诊治

作者：刘雅欣

单位：哈尔滨医科大学附属第二医院呼吸与危重症医学科

一、肺真菌病的诊治难点

提到肺真菌病，我们或许首先会想到从“侵袭性肺部真菌感染（IPFI）”到“侵袭性肺真菌病（invasion pulmonary mycosis，IPM）”概念的切换。2006年《中华内科杂志》发表的《侵袭性肺部真菌感染的诊断标准与治疗原则（草案）》中对IPFI的定义是不包括真菌寄生和过敏所致的支气管肺部真菌感染[1]，这一概念更多描述的是病原菌与宿主的一种共存状态。2007年《中华结核和呼吸杂志》发表的《肺真菌病诊断和治疗专家共识》提出了“侵袭性肺真菌病”的概念，是指真菌直接侵犯（非寄生、过敏或中毒）肺或支气管引起的急、慢性组织结构病理损害所导致的疾病[2]，“侵袭性肺真菌病”这一概念更能反映疾病的病理实质，体现了对疾病本质更深的认识。

我国一项纳入1998～2007年临床确诊肺真菌病患者的多中心回顾调查入选了10个城市16个中心的所有满足诊断标准的474例肺真菌病患者，收集临床、微生物学及影像学资料并进行回顾性分析。调查发现，在肺真菌病中，占比最高的是肺曲霉病和肺念珠菌病，两者之和约占70%[3]。这一数据与临床工作中对肺真菌病的实际诊治情况符合。

肺真菌病有一定的危险因素，包括：高龄、外周血中性粒细胞缺乏、应用广谱抗生素或类固醇激素3周以上、器官移植及接受免疫抑制剂治疗、既往侵袭性感染或定植病史、烧伤或严重创伤、合并恶性肿瘤、糖尿病等基础疾病、营养不良、胃酸抑制[4]，这些危险因素也是临床诊断肺真菌病的首要线索。

肺真菌病的常见症状包括：①持续发热＞96 h，经积极的抗生素治疗无效；②咳嗽、咳黏稠或呈黏液胶质样、咯血、胸痛、喘息、呼吸困难；③念珠菌血症时可出现肝、脾多发性小脓肿、脉络膜视网膜炎、肝功能异常、不明原因的神志障碍以及低血压、休克等。临床上无异常表现。体征方面，口咽部可见鹅口疮或散在白膜，肺部可闻及干/湿啰音，口唇发绀，胸膜摩擦音。肺真菌病常见的影像学表现为：①两肺散在斑片状影；②肺段或肺叶的实变；③多发结节状高密度影；④早期出现胸膜下密度增高的结节实变影；⑤晕轮征、空腔、新月体征；⑥新出现的肺部非特异性局部浸润影。其中，⑤和⑥往往是肺曲霉病比较有特异性的影像学表现。上述临床特征缺乏特异性，因此不能完全依据这些进行肺真菌病的诊断。

2008年指南提出了肺真菌病的分级诊断，即极似诊断、临床诊断、确定诊断三个诊断级别，分别依照危险因素、临床特征、微生物学检查和组织病理学检查结果而定。

组织病理学是肺真菌病确诊的“金标准”。判断患者是否为侵袭性肺真菌病，可以通过菌种的位置、排列、数目、宽度、分隔、分枝、染色、孢子等特征进行鉴别[5]，尤其是念珠菌、曲霉和毛霉，并且提倡广泛开展经皮肺穿刺活检或经支气管镜黏膜活检和肺活检，直接取得肺组织标本做病理学检查和特殊染色以明确病原体[4]。

组织中念珠菌、曲霉和毛霉的鉴别

然而，在临床中，活检操作往往会遇到不少的阻碍，例如患者高龄、基础状态差、难以接受有创操作、过度担忧、患者及家属不能获得知情同意等，这也阻碍了临床对肺真菌病的确定诊断。因此，调查显示肺真菌病的确定诊断率较低，也与此有关。

二、侵袭性真菌病实验室诊断方法临床应用专家共识

侵袭性真菌病的诊断引起临床多学科关注，早期明确诊断是改善患者预后的关键。为了促进临床医师深入了解并合理应用侵袭性真菌病的诊断方法，提高侵袭性真菌病的诊断水平，中国医药教育协会真菌病专业委员会联合多学科专家提出《侵袭性真菌病实验室诊断方法临床应用专家共识》[6]。共识针对侵袭性真菌病微生物学检查和组织病理学检查的临床应用，主要提出以下建议。

1. 微生物检查的临床应用

（1）真菌直接镜检：怀疑真菌感染患者的BALF标本及无菌体液（除血液外），应行真菌直接镜检，同时进行真菌培养及血清学检查。非无菌部位标本（痰、尿、粪等），如行真菌培养，需要在培养的同时行真菌直接镜检。真菌直接镜检敏感性不高，多次送检能提高检出率。活检组织标本在进行组织病理和真菌培养检查的同时，应进行直接压片，荧光染色后进行真菌直接显微镜检查。

（2）真菌培养和鉴定：在送检真菌培养检查同时，应尽可能同时送检真菌直接镜检。组织标本进行组织病理检查时，同时应进行真菌培养检查。真菌培养所需时间长于细菌培养，一般需要7 d，特殊情况需要2~4周以上，如果怀疑双相真菌感染（马尔尼菲篮状菌、组织胞浆菌等），应同时在28℃和37℃两个温度下培养。非无菌部位真菌培养阳性，存在污染菌或定植菌可能，需要对培养所获真菌进行判断，是否有临床意义（即致病真菌），需要结合真菌直接镜检、组织病理检查、患者临床表现以及真菌致病性等进行综合判断。真菌鉴定一般需要鉴定至种或复合群（complex）水平。根据菌种类型，参考相应真菌感染诊疗指南选择抗真菌药物治疗。少见真菌或从疑难重症患者分离到的致病真菌应做体外药敏试验，作为临床用药参考。

（3）血清学检查：样本类型多为血清，部分检查可用于脑脊液、BALF或其他体液。常用方法为：曲霉半乳甘露聚糖抗原检测（GM试验）和真菌1,3‑β‑D葡聚糖检测（G试验）、隐球菌荚膜多糖抗原检测（CrAg）。GM试验适用于怀疑侵袭性曲霉病的患者，可以检测血清或BALF。阳性结果是侵袭性曲霉病临床诊断证据之一。还需要结合临床表现、其他真菌学检查以及影像学表现综合判断。G试验用于怀疑侵袭性真菌病（包括念珠菌病、曲霉病、肺孢子菌病等，不包括隐球菌病、毛霉病）的患者，其阴性结果排除真菌感染的意义更大。隐球菌荚膜多糖抗原检测用于诊断隐球菌病，脑脊液或血清抗原阳性是隐球菌病的确诊证据。抗体检测适用于无明显免疫抑制人群。慢性空洞性肺曲霉病可检测曲霉IgG抗体，变应性支气管肺曲霉病患者可检测曲霉特异性IgE抗体。

（4）分子生物学检查：国外有念珠菌T2磁共振（T2MR）结合PCR技术检测念珠菌血症的设备。荧光定量PCR方法在多种深部感染真菌（曲霉、肺孢子菌、念珠菌）检测中有应用前景。二代测序不作为常规检测推荐，疑难病例可开展对无菌组织、无菌体液或BALF的二代测序。

2. 组织学检查的临床应用

本共识对侵袭性真菌病诊断方法的应用人群、送检要求、结果解读及临床意义进行了介绍并提出建议，强调对于侵袭性真菌病高危患者，应综合应用多种诊断方法、正确取材送检、提高结果解读能力、了解不同方法的临床意义，以便合理应用，更好地服务于患者。

免疫抑制人群怀疑真菌感染时，应尽可能做组织活检。活检组织做病理学检查同时，应采集新鲜组织做组织真菌培养。HE染色不易发现真菌成分，应做针对真菌的特殊染色：六胺银染色（GMS）或过碘酸希夫染色（PAS）。免疫抑制人群，不能明确感染种类时，组织病理的特殊染色需包括针对真菌的GMS或PAS；针对分枝杆菌的抗酸染色；针对细菌的革兰染色。怀疑双相真菌中马尔尼菲篮状菌或组织胞浆菌感染时，骨髓穿刺液可做吉姆萨染色。

三、mNGS在肺真菌病诊断中的应用

1. mNGS用于真菌检测的优势与劣势

近年来，mNGS在感染性疾病诊断中的应用不断增多，因其具备一定的优势：①不需要培养，节省时间；②相较于传统方法（G/GM试验）可以精确区分物种，甚至亚型，特异性高；③在某些类型真菌的检测敏感性高于传统方法，如曲霉；④无需假设，可覆盖罕见真菌和其他类型病原体；⑤可检测真菌的耐药基因。但mNGS也有一定的劣势：①对采样要求较高，需要有效采集真菌感染的病灶部位；②真菌细胞壁厚（如曲霉），或有坚固荚膜（如隐球菌），破壁困难，核酸不易释放，可造成假阴性；③在实验流程中（比如建库）容易引入环境真菌或试剂中真菌核酸（如灰绿曲霉）的污染，造成假阳性；④真菌基因组数据库不全，很多真菌缺乏全基因组数据（识别不出），且在公开的数据库中真菌序列经常存在人源序列的污染（识别错误）。

所以，mNGS检测真菌时需要注意：最佳检测标本是BALF；在技术上改进破壁技术；合理去除人源背景，提高病原体的检出率；完善真菌基因数据库。

2. mNGS的真菌检测结果的解读

mNGS检测结果回报后，如何判读？

（1）对检出的病原体分类：①高等级的致病性真菌：如曲霉、肺孢子菌、马尔尼菲篮状菌、新生隐球菌，在大部分样本中都可能是病原体。②中等级的条件致病菌：如念珠菌属，在外周血、脑脊液、穿刺液等无菌体液样本中可能是病原体。③低等级的条件致病菌：如念珠菌，痰液、BALF、尿液等大部分样本中可能是共生菌，只在少数情况下如侵入操作后的脑脊液/外周血样本、感染性心内膜炎的赘生物中可能致病。④疑似背景微生物引起的感染：在某些感染样本中能与低等级的条件致病菌相互转化，需要结合患者传统微生物学检查结果及临床特征进行判断。

（2）结合临床判读结果：①阳性结果的判读：a. 若mNGS结果阳性且符合临床表现和其他实验室检查，推荐根据mNGS结果指导临床决策。b. 若mNGS结果阳性且符合临床表现，但缺乏其他实验室证据，应进行PCR验证，并完善传统实验室检查加以验证。c. 若mNGS结果阳性，但临床表现或实验室检查结果不支持，应以传统实验室检查结果为首要临床参考依据。②在阴性结果的判读中：真阴性，排除感染；假阴性，根据其他辅助检查结果高度提示感染可能，建议再次重复mNGS检测。

3. mNGS在真菌感染诊断中的价值

目前，分子生物学（PCR、mNGS）已经在临床实践中广泛应用，其中PCR在曲霉和念珠菌感染病理标本中有确诊价值。对于真菌感染的分子生物学检测，目前国内外只认可PCR；不论曲霉还是念珠菌，如果组织标本的PCR阳性均属于确诊依据；而血清、BALF的PCR检测阳性只能作为曲霉的临床诊断依据。

mNGS在我国刚刚普及，正在累积经验，可以作为辅助诊断的指标，尚不能作为病原学的确诊依据。mNGS为临床提供了一种具有很高敏感性和特异性的病原微生物检测方法，具有划时代意义。此外，mNGS不应该用于普通感染患者，而应在疑难、危重、特殊感染患者中使用，目前不倡导将其用于疗效随访和耐药性检测。临床中应重点关注mNGS报告的正确解读，要做到小心谨慎，结合临床，综合评估。

四、总结

肺真菌病缺乏特异的临床特征，组织病理结果是金标准，但也使得确定诊断困难。《侵袭性真菌病实验室诊断方法临床应用专家共识》针对侵袭性真菌病微生物学检查和组织病理学检查的临床应用，对侵袭性真菌病诊断方法的应用人群、送检要求、结果解读及临床意义进行了介绍并提出建议，强调对于侵袭性真菌病高危患者，应综合应用多种诊断方法、正确取材送检、提高结果解读能力、了解不同方法的临床意义，以便合理应用，更好地服务于患者。新的检验手段如mNGS的出现有助于临床肺真菌病的精准诊断，但主要推荐用于疑难危重、特殊感染的患者。无论何种实验室检测方法，都需要结合临床评估才有意义。

参考文献

[1] 中华内科杂志编辑委员会. 侵袭性肺部真菌感染的诊断标准与治疗原则（草案）[J]. 中华内科杂志, 2006, 45(8):697-700.

[2] 中华医学会呼吸病学分会感染学组, 中华结核和呼吸杂志编辑委员会. 肺真菌病诊断和治疗专家共识[J]. 中华结核和呼吸杂志, 2007, 30(11):821-834.

[3] 刘又宁, 佘丹阳, 孙铁英, 等. 中国1998年至2007年临床确诊的肺真菌病患者的多中心回顾性调查[J]. 中华结核和呼吸杂志, 2011, 34(2):86-90. 

[4] 施毅，刘又宁，张波，等. 肺念珠菌病[J]. 中国感染与化疗杂志，2011，11（2）：114-118.

[5] 廖万清，吴绍熙. 现代真菌病学[M]. 上海：复旦大学出版社，2017：227.

[6] 中国医药教育协会真菌病专业委员会, 国家皮肤与免疫疾病临床医学研究中心（北京大学第一医院）, 国家血液疾病临床医学研究中心（北京大学人民医院）. 侵袭性真菌病实验室诊断方法临床应用专家共识[J]. 中华内科杂志, 2022, 61(2):134-141. 

作者简介

刘雅欣

• 哈尔滨医科大学附属第二医院呼吸与危重症医学科 副主任医师，医学博士
• 黑龙江省医学会呼吸病学分会委员
• 中国肺癌防治联盟黑龙江省分联盟委员
• 中国肺癌防治联盟哈医大二院结节诊治分中心委员
• 黑龙江省医疗保健国际交流促进会呼吸与危重症分会委员
• 作为副主编译作1部，参与多项课题研究
• 对呼吸内科常见疾病有扎实的理论知识基础以及较丰富的临床经验，熟练掌握呼吸内科各种临床操作技能

*本文根据“呼吸危重症菁英秀”第四十六期专题视频整理，感谢刘雅欣医师予以审核。