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Nuclear-Encoded lncRNA MALAT1 Epigenetically Controls Metabolic Reprogramming in HCC Cells through the Mitophagy Pathway Mol Ther Nucleic Acids. 2020 Oct 4;23:264-276. IF:8.886（2区Q1）. 研究背景：细胞能量学的失调一直被认为是恶性肿瘤的标志之一，包括肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)，因为线粒体生物能学、生物合成和信号传导的变化是肿瘤发生的必要条件。靶向癌细胞中异常的能量代谢可能成为开发新的癌症治疗药物的重要策略。线粒体相关的lncRNAs，包括来自mtDNA的RNA和被运输到线粒体的核编码lncRNA，可能与转录因子和其他表观遗传调控因子协同工作，调节线粒体基因表达和线粒体功能。线粒体相关lncRNA的异常调控可能导致细胞衰老和肿瘤发生，核基因组编码lncRNAs可以作为“顺行信号”调节线粒体功能与RNA转运体到线粒体，而线粒体基因组转录lncRNAs可能穿梭通过RNA转运体到细胞核，在那里他们可以调节核基因组的功能，作为一个“逆行信号”。无论是核基因组编码还是线粒体基因组转录，都可能在癌细胞线粒体代谢异常中发挥关键作用。核基因组转录的lncRNA MALAT1在肝细胞癌细胞的线粒体中发现。因此，lncRNA可能作为重要的信使分子，与细胞核基因组和线粒体基因组的调控有关。 结果分析 Nuclear-Encoded lncRNA MALAT1 Is Aberrantly Enriched in the Mitochondria of Hepatoma Cells 核编码的lncRNA MALAT1在肝癌细胞的线粒体中异常富集
为了表征代谢重编程的调节成分，从肝癌HepG2细胞（人肝细胞癌细胞系）和正常肝HL7702细胞（人正常肝细胞系）中分离了线粒体。在分离的线粒体RNA中检测到MALAT1的富集，进行了RNA转录组测序(RNA-seq)来鉴定线粒体中的RNA，共鉴定了246个在HepG2和HL7702细胞之间差异表达的RNA（图A/B）。通过qPCR，证实了肝癌HepG2细胞的线粒体MALAT1丰度是正常肝脏HL7702细胞的大约12倍。此外，该核编码的lncRNA也大量定位于另外两种人肝癌细胞系（Huh751和SMMC-7721）的线粒体中（图C）。使用RNAFISH验证了HepG2线粒体中MALAT1lncRNA的存在。观察到MALAT1（红色）和MitoTracker（绿色）在个体、蛇形和小片段样线粒体中的共定位（图D），RNA FISH的定量也证实了MALAT1在线粒体中的定位（图E/F）。这些数据表明，在HepG2细胞中，核编码的lncRNA MALAT1中可以被转运到线粒体。 MALAT1 Binds to mtDNA and Alters Its Epigenotype MALAT1与mtDNA结合并改变其表观基因型
在细胞核中，MALAT1通过改变lncRNA与DNA结合的表观基因型来调控多个基因靶标。为了确定MALAT1是否利用类似的机制调控线粒体基因，进行了RNA逆转录相关陷阱测序（RAT-seq），确定了特定的MALAT1-mtdna相互作用位点，发现MALAT1与多种mtDNA相互作用，包括MT-RNR1、MT-RNR2、MT-CO2、MT-ND3和MT-CYTB（图A）。MALAT1-mtDNA的相互作用通过ChIRP检测(通过RNA纯化进行染色质分离)进行验证，用qPCR对MALAT1-mtDNA相互作用位点的mtDNA进行定量，该实验证实了MALAT1与mtDNA在D-loop、MT-CO2和MT-ND3位点的结合（图B）。 MALAT1 Is Essential for Mitochondrial Function in HepG2 Cells MALAT1对HepG2细胞的线粒体功能至关重要 研究了MALAT1是否参与了线粒体生物发生和能量学的调控，MALAT1基因敲低的细胞表现出基础呼吸、ATP产生能力、最大呼吸和备用呼吸能力下降，MALAT1消耗后，与对照组细胞相比，HepG2细胞的基础呼吸能力降低（图A）。然而，根据细胞外酸化率(ECAR)来评估，糖酵解功能没有显著变化（图B）。定量分析线粒体产生ATP的能力。与对照组相比，MALAT1基因的敲低显著降低了ATP的合成（图C）。癌细胞增加了线粒体来源的活性氧(mROS)的产生，这是线粒体电子传递链的副产品，可能导致致瘤信号通路的激活和代谢重编程。使用MitoSOX测量了mROS，发现shMALAT1-1/2细胞中的mROS明显低于对照组细胞（图D/F）。还测量了线粒体Mn-SOD的活性，这是一种消除mROS的抗氧化酶。发现敲除shMALAT1显著提高了其在线粒体中的特异性酶活性（图E）。 Enrichment of MALAT1 Affects Mitochondrial Apoptosis MALAT1的富集影响线粒体凋亡
在shMALAT1处理的HepG2细胞中，线粒体凋亡增加，观察到线粒体肿胀，泡基质室增大，肿胀的泡质室周围的小泡基质室，内边界膜缺失（图A）。MALAT1敲低诱导了一系列与线粒体凋亡相关的事件，包括caspase-3激活、细胞色素C表达增加、Bcl-2表达减弱。在shMALAT1处理的细胞中，线粒体凋亡激活因子BAX被下调，提示shMALAT1诱导的细胞凋亡可能不是来自于激活的BAX寡聚物孔的形成（图B/C）。采用AnnexinV/7-AAD荧光活化细胞分选(FACS)染色对凋亡细胞进行进一步定量。流式细胞仪的标准点图说明了细胞死亡的进程，Q1、Q2、Q3分别代表健康细胞、凋亡细胞和坏死细胞。发现下调MALAT1可诱导HepG2细胞凋亡（图D/E）。这些发现表明，MALAT1是通过抑制线粒体特异性凋亡来维持正常线粒体功能所必需的。使用JC-1染色测量了线粒体膜电位，发现，MALAT1的敲低增加了线粒体膜电位的丢失，证实了HepG2中MALAT1的敲低触发了细胞凋亡的早期事件（图F）。 MALAT1 Functions via the Mitochondrial Autophagy Pathway MALAT1通过线粒体自噬途径发挥作用
使用蛋白印迹法来测量这些线粒体吞噬途径蛋白。经shMALAT1处理的细胞显示出线粒体吞噬事件的显著减少。与对照组细胞相比，MALAT1敲低细胞的线粒体自噬标志物表达减少，特别是PINK1、SQSTM1/p62、NDP52、BNIP3和LC3B-I/II（图A/B）。当自噬被诱导时，LC3B-II/I比值（是监测细胞自噬的敏感定量指标）增加。MALAT1基因敲除后，LC3B-II/I比值显著降低（图C）提示MALAT1在这个自噬过程中起着关键作用。使用溶酶追踪器标记溶酶体，发现与对照组细胞相比，MALAT1处理的细胞中红色（酸性）溶酶体的数量显著减少，表明在MALAT缺陷的细胞中溶酶体功能受损（图D）。 Effect of MALAT1 on the Biological Behavior of Hepatocellular Carcinoma Cells MALAT1对肝癌细胞生物学行为的影响
MALAT1与肺癌的侵袭和转移相关。使用Transwell检测了shMALAT1-1/2细胞的侵袭情况，发现侵袭MALAT1敲低细胞的平均数量明显低于HepG2随机载体细胞(shCT)（图A）。类似地，MALAT1基因的敲低也改变了细胞的增殖（图B）、伤口愈合（图C）、细胞周期的进展和克隆的形成。 讨论
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