|
2023年6月12日 理化学研究所 世界最快简易基因检查法“Direct-SATORI法”的开发-作为通用的病毒检查法，期待在农业医疗领域的实用化－ 理化学研究所(理研)开拓研究总部渡边分子生理学研究室的渡边力也主任研究员、筱田肇研究员、上田智也基础特别研究员等研究小组开发出了世界上最快的可以从生物试样中直接检测病毒的非扩增基因检查法“Direct-SATORI法”，从生物试样中提取8种病害病毒，持续15分钟本研究成果作为包括病毒病诊断在内的新一代基因检查方法，有望在从农业到医疗的广泛领域得到实用化。 此次，研究小组大幅改善了2021年度发表的世界上最快的基因检查法“SATORI法”，开发了可以从生物试样中直接检测病毒基因的Direct-SATORI法。 Direct-SATORI方法可以省去传统的基因检测限速: (1)基因提取纯化，(2)基因扩增两个步骤，大大缩短了检测时间，实现了多种病毒的并行/多项检测。 另外，通过优化2022年度发表的全自动装置“opn-SATORI装置”，实现了使用Direct-SATORI法的全自动基因检查，在使用番茄叶片的验证实验中，在15分钟内成功地全自动检测出了8种病害病毒 检测时间与以往方法( PCR法)相比缩短到十分之一以下，进而达到了灵敏度[1]96%、特异度[2]99%。 本研究刊登在科学杂志《Analytical Chemistry》在线版( 6月12日:日本时间6月12日)上。  本研究方法的概要图 背景我们为了经历新型冠状病毒肺炎( COVID-19 )，为将来的大爆发做准备，确立通用的感染检查法是当务之急。 传统的以人类、动物、植物等为对象的病毒病诊断，主要采用检测病毒蛋白质抗原的方法(抗原检查法)和扩增基因检测的方法(核酸检测法[3] )，分别根据筛查、确诊等用途分开使用。抗原检查法可以在30分钟左右迅速简便地检测出病毒，所以适合筛选，但由灵敏度和特异性低引起的检测错误很多是个问题。 另一方面，尺核酸检测灵敏度优异，适用于确诊，但检测的预处理最短需要1小时左右，因此很难迅速分析大量的检测体并进行诊断。 因此，核酸检测法的“灵敏度高”和抗原检查法的“迅速简便”并存的新检查方法的开发备受期待。
鉴于这一背景，迄今为止，研究小组开发了世界上最快的基因检查法“SATORI法”( 2021年度发表)注1 )及其全自动装置“opn-SATORI装置”( 2022年度发表)注2 )。 SATORI方法使用集成了酶和微试管的微芯片，称为CRISPR-Cas13a[4]，在“单分子”水平上识别病毒基因，实现了9分钟内世界上最快的快速检测(图1 )。 检出限浓度为每微升(μL，1μL为百万分之一升) 1.4个拷贝(与核酸检测法大致相当)，在使用COVID-19临床标本的验证实验中，在阳性判定和变异毒株判定中达到了98%以上的正确率，这是一种与现有技术检测原理不同的创新基因检查方法。但传统的SATORI方法无法直接从生物样品中检测出病毒，需要使用其他装置预先提取纯化病毒的基因。 因此，在临床现场采集生物试样后，完成SATORI法的全部工序至少需要30分钟以上的时间等，被强烈期待着进一步简化检查工序和缩短检查时间。 图1独特的世界最快基因检测法( SATORI法) 核酸切割酶Cas13a与荧光报告、样本病毒RNA混合后，特异性地形成病毒RNA和Cas13a的复合体。 复合体形成后，打开Cas13a的酶活性开关，荧光基团和消光基团连接的荧光报告被切断。 将其细分封入微芯片阵列后，只有存在病毒RNA的微小试管的荧光信号会在1分钟内上升。 将微芯片荧光信号的有无二值化，根据该数字信号计数有信号的微小试管的个数。 因为微试管内只存在一个病毒RNA，所以所计数试管的个数相当于样品中病毒RNA的个数。
研究方法和成果研究小组大幅改善了2021年度发表的世界上最快的非扩增基因检查法SATORI法，开发出了可以从生物试样中直接检测病毒基因的“Direct-SATORI法”(图2 )。 Direct-SATORI方法可以省去传统的基因检测限速: (1)基因提取纯化，(2)基因扩增，大大缩短了检测时间，实现了多种病毒的并行/多项检测。 另外，通过优化2022年度发表的全自动装置opn-SATORI装置，实现了使用Direct-SATORI法的全自动基因检查。 详细的改善点如下。
 图2与传统基因检测方法的检测时间比较 采集生物样品后检查时间的详细情况。 作为例子，给出了使用植物叶子的基因检查的详细内容。 采用Direct-SATORI法进行全自动基因检测，在番茄叶片验证实验中，发现有8种病害病毒(番茄花叶病毒: ToMV，番茄超级病毒: TAV，番茄黄化病毒: TSWV 在15分钟内成功全自动检测到马铃薯y病毒: PVY、烟草花叶病毒: TMV、烟草坏死病毒: TNV (图3 )。 检测时间缩短到以往方法( PCR法)的十分之一以下，灵敏度达到了96%，特异度达到了99%。 另外，用于验证实验的番茄叶片仅为1mg，以往的检查方法需要50mg左右，这表明在现场采集微量样品进行迅速检查方面，Direct-SATORI法是有效的。  图3 Direct-SATORI法检测番茄病毒病多项快速基因
今后的期待Direct-SATORI法是一种高灵敏度、高精度且迅速的新基因检查方法，省略了以往的基因检查的限速过程。 15分钟内即可从生物样本中直接检测出最多8种病原病毒，有望成为后冠状病毒社会中识别诊断多种传染病的通用基因检查方法(图4 )。 另外，Direct-SATORI法可以直接从生物样品中检测病毒的基因，不需要传统方法中使用的基因纯化装置，检测工序非常简单。 此外，由于消耗品的成本在8种病原病毒的同时检查中约为15.6美元，因此今后，Direct-SATORI法在满足迅速且低成本的基因检查需求的同时，也有望为医疗和农业相关的各种病毒病的预防做出贡献。  图4 Direct-SATORI方法前景展望:医疗农业领域通用基因检测方法 补充说明
研究小组理化研究所开拓研究总部渡边分子生理学研究室 主任研究员渡边力也 研究员筱田肇 基础特别研究员上田智也 技术人员ⅰ饭田龙也 技术人员ⅰ牧野麻美 技术人员ⅰ吉村麻实 研究支援本研究由科学技术振兴机构( JST )战略性创造研究推进事业CREST“细胞外微粒引起的生命现象的阐明及其控制的基础技术的创造(研究总结:马场嘉信、JPMJCR19H5 )”、 日本学术振兴会( JSPS )科学研究费资助事业学术变革领域研究( a )“未开拓蛋白质的1分子计测技术·设备开发(研究代表者:渡边力也，20H05931 )”，同基础研究( a )“以数字检测技术为基础的病毒新型感染诊断法的开发(研究代表者: ) 在以日本医疗研究开发机构( AMED )“官民对年轻研究者的发掘支援事业( JP22he0422018 )”、浦上食品·饮食文化振兴财团研究资助为首的各机构的支持下进行。 原论文信息
主讲人理化研究所 开拓研究总部渡边分子生理学研究室 主任研究员渡边力也 研究员筱田肇 基础特别研究员上田智也 |
|
|
