Science：利用植物生产的疫苗和治疗药物，开启分子农业新时代|HBsAg|转基因|疫苗|药物|序列|小鼠|

编译 |  W.N、生物世界

来源 |  植物生物技术Pbj

治疗性蛋白质如疫苗、抗体、激素和细胞因子通常在 细菌 或 真核系统 中产生，包括鸡卵、哺乳动物或昆虫细胞培养物。

1986年，首次提出了利用植物生产治疗性蛋白质的生物制造替代方法，也就是所谓的“ 分子农业 ”。2012年，第一种也是目前唯一一种植物源治疗蛋白被批准用于治疗戈谢病 （Gaucher disease） 。 注： 戈谢病 是一种家族性糖脂代谢疾病，为染色体隐性遗传的罕见病，是溶酶体沉积病中最常见的一种。

2019年，一种植物源性四价病毒样颗粒流感疫苗完成了3期临床试验，并取得了令人鼓舞的结果。

2021年3月，一个针对新冠病毒的辅助植物疫苗 （CoVLP） 开启了3期临床试验。

这些成功案例重新激起了人们对使用植物制药的兴趣，其中也包括可食用药物。

2021年8月13日，加拿大拉瓦尔大学医学系的研究人员在 Science 期刊发表了题为： Plant-made vaccines and therapeutics 的观点文章。 对植物如何助力于疫苗生产和相应疗法提出了详尽的观点。

植物生长只需要阳光、水和土壤。温室的构建比生物反应器组便宜，而生物反应器组是细菌、哺乳动物和昆虫细胞培养系统所必需的。此外，疫苗的产量可以根据种植的植物数量按比例增加或减少。与传统生产系统不同，人畜共患病原体不能感染植物，因此不会成为分子农业衍生产品的污染源。

密码子优化、细胞器特异性启动子的克隆、N-聚糖的人性化和瞬时转染系统等技术的进步，提高了分子农业的性能，产量能达到1mg/g新鲜植物。相比之下，在用于制造单克隆抗体的哺乳动物中国仓鼠卵巢细胞培养物中，产量通常达到5~20g/L。瞬时转染系统也提高了生产速度，在转染成年植物后几天内即可收获，而不需要在几个月内寻求稳定表达。分子农业的生产速度是一项显著优势。实际上，植物生产的疫苗可以很容易地针对新的病原体或新出现的菌株进行生产，第一批候选疫苗通常在3周内生产。分子农业的速度特别适合于个性化医学，在这种医学中，药物需要为个体患者定制，例如癌症治疗。

在符合药品生产质量管理规范的条件下，建设能够纯化植物中治疗性蛋白的设施，也支持了植物疫苗和治疗药剂的临床评估。此外，与植物生长的简单性和低成本相比，分子农业的提取、纯化和填充过程需要相对更昂贵的GMP设施。产量较低、可用的指南有限以及全球范围内有限的生产力是抑制人们对分子农业的热情的主要原因。

就疫苗而言，植物产生的蛋白质与细菌、哺乳动物或昆虫系统中产生的蛋白质相比有诸多优点。与细菌不同，植物能够进行翻译后修饰。植物表达不同的聚糖，这使得植物来源的蛋白质比它们的哺乳动物对应物更具免疫原性。在植物制成的疫苗中，产生病毒样颗粒 （VLP） ，其包含目标病原体的免疫原和颗粒中的植物成分。病毒样颗粒（VLP）的这些植物成分，如凝集素、聚糖、皂苷和热休克蛋白，具有佐剂特性，可以进一步增强针对植物疫苗的免疫反应，并可以减少疫苗配方中对佐剂的需求。这种增强的免疫刺激可能导致对植物成分的过敏反应。然而，针对CoVLP的1期试验 （NCT04450004）  和针对流感病毒的植物疫苗的3期试验 （NCT03301051，NCT03739112） 缓解了这种担忧。在涉及两万多名18-94岁成年人的大型3期临床试验中，四种不同病毒样颗粒（VLP）的混合物显示出与现有流感疫苗相似的功效，每种病毒样颗粒（VLP）都含有来自烟草植物中产生的选定季节性流感病毒株的血凝素蛋白。值得注意的是，与已接受许可的流感病毒疫苗的个体相比，用这种四价病毒样颗粒（VLP）制剂产生的免疫并没有导致不良事件或超敏反应的增加。

针对流感病毒和新型冠状病毒的植物疫苗有望成为第一批在全植物中生产的供人类使用的治疗性蛋白。葡萄糖脑苷脂酶是一种可注射的蛋白质药物，用于治疗戈谢病，在胡萝卜细胞培养物中产生。几种植物生产的兽用疫苗也已经被开发出来，其中一种被美国农业部批准用于鸡的新城疫。 注：新城疫是由新城疫病毒引起禽类的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病。

植物蛋白免疫原性的增强对疫苗有益，但对治疗蛋白有害，有可能降低其体内效力并导致不良事件。尽管有这些限制，抗艾滋病 （NCT01403792） 和埃博拉 （NCT02363322，NCT02363322）  的单克隆抗体已经达到临床开发阶段。

在人体试验中，静脉注射 （针对埃博拉） 或阴道内注射 （针对艾滋病） 这些抗体通常表现出良好耐受性。静脉给药后观察到轻度不良事件，如低血压和发热。仅在接受抗艾滋病毒或埃博拉病毒抗体治疗的238名受试者中报告了危及生命的反应，如过敏性休克。在静脉注射植物产生的药物之前给予抗组胺剂和退热剂能减轻严重不良事件的发生。

使用工程化的植物来表达人类聚糖也降低了植物蛋白的免疫原性。值得注意的是，独立于生产系统，静脉注射抗体与一些不良事件有关，即使在哺乳动物细胞中产生的抗体也观察到了这些不良事件。植物制造的单克隆抗体的另一个障碍是制造能力有限。与疫苗不同，单克隆抗体方案通常需要更大的剂量 （50~150mg/kg） ，有时需要重复给药。为了达到植物制造抗体所需的规模，需要大幅扩大目前的生产能力。

口服用药是静脉注射途径的一种用户友好的替代方法。此外，口服用药可以减轻与静脉用药相关的不良事件。肠道免疫反应对于耐受食物和自身抗原至关重要，并在确保免疫系统平衡方面发挥重要作用。此外，目前正在临床评估的大多数药用蛋白质在注射前都经过纯化。口服用药，植物制成的治疗剂只需更少的加工，因此可能跳过制造过程中昂贵且耗时的步骤。用于口服给药的产品也可以以冻干的形式在室温下长期储存，因此大大降低了它们的生产和储存成本。

可食用植物如谷类作物、番茄、玉米和大米用于口服植物制造的治疗性蛋白。肿瘤坏死因子拮抗剂的胃肠外给药用于治疗自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎。在1期临床试验中，口服表达肿瘤坏死因子拮抗剂的烟草植物冻干细胞是安全的，并且增加了人类志愿者身上的免疫抑制调节性T细胞，证明了这种方法的可行性。除了减少不良事件外，口服途径有利于诱导耐受性，以抑制自身免疫或过敏反应。迄今为止，通过在可食用植物中使用重组蛋白诱导耐受性仅限于超敏反应或自身免疫的动物模型。然而，这可以提供低成本和简单的解决方案来更好地降低对常见物质的过敏发生率。

食用疫苗也在开发中。这种方法的安全性和可行性在概念验证1期临床试验中得到证明，以监测 1998-2004 年间发生的针对大肠杆菌、乙型肝炎病毒、狂犬病病毒和诺如病毒的可食用候选疫苗的安全性和免疫原性。在这些试验中，产生针对期望目标的免疫应答的免疫个体的比低于涉及通过肠胃外途径给药的标准疫苗的临床试验，这样的结果令人失望。从那以后，植物中产生的重组蛋白产量大幅增加，这表明新的可食用植物疫苗现在可以产生有意义的免疫反应。然而，在临床接受这些候选疫苗之前，需要进一步优化。确保可食用的植物疫苗不会导致对用于生产的植物过敏至关重要，尤其是广泛消费的植物，如大米、谷物和玉米中。

鉴于3期临床试验的良好结果，植物制成的四价病毒样颗粒 （VLP） 流感疫苗很可能获得使用许可。正在进行的临床开发将继续为植物制造的治疗蛋白的监管指南提供信息。然而，由于治疗剂的剂量比疫苗高得多，制造基础设施的投资必须增加，生产成本需要进一步降低，以实现植物治疗产品的大规模制造。

在此之前，分子农业的速度将有助于候选治疗药物的临床前和早期临床评估。可食用的植物制成的治疗药物仍主要处于临床前开发阶段，但是一旦成功，可能会创造新的药品类别。药物蛋白的生产可能仍由当前的生产系统主导，直到通过简单的生产和技术进步 （如有效的可食用植物制成的治疗剂） 产生的经济吸引力将平衡转向分子农业。

延伸阅读

让生菜成为制药工厂，治疗乙肝

2019年7月1日，Nature Plants 发表了一篇题为： Lettuce-manufactured pharmaceuticals  的研究亮点文章，介绍了南京大学 张辰宇 团队发表于 BioMaterials 期刊的研究论文。

食物是维持生命和生长的营养物质，医学是用于治疗疾病的方法。许多人相信传统医学和食物的同源性，尤其是东亚人。如今，转基因技术使植物能够产生治疗分子，这进一步模糊了食物和药物之间的界限。

近日，来自南京大学的张硕等人，在 Biomaterials 杂志发表研究论文，该研究 开发了一种转基因生菜，能够生产治疗药物，可用于治疗乙型肝炎病毒 （HBV） 感染 。

他们设计了两种针对乙型肝炎病毒 （HBV） 表面抗原 （HBsAg） 的人工miRNA （amiR471和amiR519） ，并在转基因生菜品种中稳定表达。

给基因工程小鼠喂食这种生菜，能够有效降低HBsAg的表达，抑制HBsAg表达引起的肝损伤，且没有不良反应 。

植物是食品和药品的天然制造工厂，在这项研究中，表达小人工RNA的生菜可能成为营养蔬菜，并可能成为将来人类治疗乙肝病毒感染的有效方法。

然后，下一步是什么？发展植物制药的现代工业？

基因治疗的绿色革命

在20世纪50年代初的“绿色革命”，通过矮杆水稻的广泛种植解决了发展中国家的粮食问题。目前，慢性乙型肝炎病毒 （HBV） 感染已成为一个重大的公共卫生问题。根据世界卫生组织的公告，大约有2.57亿人感染了乙型肝炎。最近的研究表明，在乙肝患者和转基因小鼠中，乙型肝炎病毒表面抗原基因 （HBsAg） 的表达水平与肝细胞癌或纤维化的发生有关。因此，HBsAg逐渐成为乙型肝炎治疗的一个新靶点。

2012年，南京大学院张辰宇教授在 Cell Research 杂志发表论文，发现植物miRNA可以通过食用进入体内，并调控哺乳动物的基因表达。后续的多项研究表明，植物miRNA可以通过食用靶向流感病毒，预防流感；甚至可以抑制乳腺癌进展。

详情点击： miRNA的跨界调控：植物miRNA能调控人类基因，甚至能抗癌

2019年6月21日，张辰宇团队更进一步，在生菜中产生针对HBsAg基因的干扰RNA序列，再通过食用生菜，就可以特异地结合并抑制基因工程小鼠中HBsAg基因的表达。与人工合成siRNA相比，这种植物来源的干扰RNA用量更低。

该研究成果以  Plant-derived RNAi therapeutics: A strategic inhibitor of HBsAg  为题，发表于 Biomaterials 期刊。

更重要的是，连续服用这种植物汤剂15个月，有效减轻了转基因小鼠的肝损伤且没有产生可观察到的不良反应。

在此项研究中，研究人员设计了两条针对HBsAg的干扰RNA序列siR471和siR519，并验证了序列对转基因小鼠原代肝脏细胞中HBsAg的表达具有抑制作用。

随后利用植物中保守且高表达的微小核糖核酸骨架基因，在可食用生菜中高效表达出目的干扰RNA序列 （amiR471和amiR519） 。在药物代谢动力学分析中发现，amiRNAs可以通过胃肠屏障进入血液和肝脏并且比合成的序列具有更好的稳定性，在较少的积累量下可以有效抑制HBsAg的表达。添加miRNA抑制剂，可以有效阻止amiRNA的抑制作用并通过5’-RACE实验确定了amiRNA在HBsAg基因上的结合位点。

持续喂食转基因小鼠含有amiRNAs的汤汁可以显著改善小鼠血清学和免疫学指标，缓解了转基因小鼠的肝损伤且没有诱导任何可观察到的不良反应 （下图） 。

图1. 持续喂食转基因小鼠amiRNA汤汁缓解了HBsAg基因表达引起的肝脏损伤

这项研究巧妙利用植物内源性微小核糖核酸(microRNA)生物合成机制产生末端甲基化的干扰RNA序列，提高了目标干扰RNA的稳定性，降低了生产成本。因此，这项工作不仅为发展中国家的慢性乙型肝炎患者提供了一种经济适用的治疗策略，同时也降低了所需RNAi药物的服用剂量，最大限度地减少了RNAi治疗中潜在的脱靶副作用并允许患者在较长的时间内甚至与其他抗病毒药物共同用药。 

对于处于免疫耐受期或对常规抗病毒治疗有抗性的患者，这种基于RNAi的治疗也可能通过每日食用这种含有HBsAg干扰RNA的植物汤汁降低肝损伤风险。

从长远来看，由于工程植物生产干扰序列的有效性、无毒性且经济可行的优势，这种方法也可以拓展到丙型肝炎或其他传染疾病的治疗。可以预测，植物来源的干扰RNA将在RNAi基因治疗中带来一场新的“绿色革命”。

回顾过去，第一场绿色革命给我们带来了更丰富的食物供给。与此同时，我们也应该了解，日常饮食也在改变我们人类自身，人体从食物中获取的小RNA可能正在发挥着重要作用。

参考文献：

https://science./content/373/6556/740

https://www./pdfs/journals/lancet/PIIS0140-6736(20)32014-6.pdf

https:///10.1016/j.biomaterials.2019.04.033

https://www./articles/s41477-019-0484-y