看看哈佛大学怎么用“抗炎 机械”疗法修复老化的肌肉

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骨骼肌老化导致肌肉质量和力量以及肌肉从受伤中恢复的能力逐渐丧失，最终损害身体表现并导致功能受限。老年患者的并发症发生率更高、住院时间更长以及受伤后无法完全恢复功能。这种再生能力下降是由于老年肌肉干细胞行为的内在损伤以及肌肉微环境中许多与年龄相关的变化（包括免疫系统），这是肌肉修复的关键组成部分。免疫反应中与年龄相关的功能障碍，称为免疫衰老或“炎症”，会导致受伤后出现慢性炎症状态，并且与老年人的肌肉不良再生结果有关。

此外，由于使用手术或药物治疗老年肌肉损伤可能会受到老年患者医疗禁忌症的限制，因此依赖于使用物理组织操作（例如按摩）的替代非侵入性疗法可能会提供更安全的选择。虽然基于机器人驱动的机械负荷 (ML) 疗法（“机械疗法”）可以促进严重骨骼肌损伤后的再生，但这种方法在衰老过程中的有效性尚不清楚，并且可能受到与年龄相关的骨骼愈合能力下降而进一步影响到肌肉恢复。

为了解决这一认知差距，来自美国哈佛大学的D. J. Mooney团队使用了一种非侵入性、负载控制的机器人设备来施加高度定义的组织应力，以评估ML对损伤后肌肉修复的年龄依赖性。发现受伤肌肉对机器人驱动的循环压缩载荷的反应对年龄十分敏感，这表明 ML 不仅对受伤的老年肌肉缺乏修复作用，而且还会加剧组织炎症。单独使用 ML 也会破坏老化肌肉干细胞的正常再生过程。然而，这些负面影响可以通过在 ML 应用的同时引入抗炎疗法来逆转，即使在老年小鼠中也会导致提升骨骼肌的再生能力。相关工作以题为“Anti-inflammatory therapy enables robot-actuated regeneration of aged muscle”的文章发表在2023年3月22日的国际顶级期刊《Science Robotics》。

1. 创新型研究内容

这项工作使用两步过程模拟了严重的肌肉损伤，该过程包括肌肉注射肌毒素到胫骨前肌 (TA) 肌肉，然后诱导后肢缺血（图 1）。肌毒素在肌纤维中诱导严重坏死，同时使细胞外基质完好无损并保留卫星细胞群，后肢股动脉结扎会加剧并延长损伤。本研究首先研究了年轻（2 至 3 个月大）和老年（20 至 22 个月大）动物严重受伤的 TA 肌肉恢复的差异。如图 1 所示，观察到老化肌肉的愈合能力明显受损。受伤后 14 天，受伤的年轻肌肉产生的强直收缩力与未受伤的年轻肌肉相匹配，而即使到第 21 天，受伤的老年肌肉产生的强直收缩力也不会超过未受伤的老年肌肉的 35%。此外，在连续刺激后，与年轻肌肉相比，老年肌肉的抗疲劳性显着降低，并且 TA 与体重的比率也较低。在结构上，在受伤后 14 天，老年肌肉比年轻肌肉表现出更高百分比的受损肌纤维和更大程度的纤维化，如在苏木精和伊红 (H& E) 和马松染色后的切片结果对比，发现老化肌肉更频繁地出现钙化和脂肪沉积。本研究进一步对老年和年轻肌肉中的 Pax7+ 细胞进行量化，以评估损伤后肌肉干细胞的增殖反应。虽然 Pax7 由静止肌肉干细胞（也称为卫星细胞）表达，但它也在活化的肌肉干细胞 [也称为生肌前体细胞 (MPC)] 上进行表达。这些 MPC 构成了在染色的肌肉切片中观察到的 Pax7+ 细胞的大部分，并且这种染色模式与在评估肌肉干细胞对损伤的反应的其他研究中观察到的一致。未受伤的老年肌肉和年轻肌肉中的总 Pax7+ 细胞相似；然而，与老年肌肉相比，损伤后 3 天在年轻肌肉中观察到Pax7+ 细胞增加更多，这证明年轻 MPC 群体的增殖反应更强烈。

图1 衰老的骨骼肌在受伤后表现出愈合受损和炎症消退不良

本研究使用具有软弹性界面的机器人加载装置对受伤后肢的 TA 肌肉施加循环压缩加载（图 2）。致动器配备了力反馈控制，以确保在治疗过程中和动物之间保持一致、可重复的加载。为了防止驱动过程中肌肉的偏转或平移，本研究使用刚性 U 形肢体皮套支撑肢体，并用硅胶系带固定脚踝。严重受伤的年轻和年老 TA 肌肉在受伤后 1 天开始接受每日 ML 治疗（0.15 或 0.3 N，1 Hz，80% 占空比，10 分钟/天）。对照动物受伤但未接受 ML 治疗。这些研究中使用的负荷大小是根据先前的一项研究选择的，该研究评估了年轻的 TA 肌肉对一系列力（0.15 至 0.6 N）的反应，这些力产生约 10 至 40% 的压缩应变。为了选择老年实验组的年龄范围并评估肌肉对负荷的反应作为年龄的函数，本研究首先评估了年轻（2 至 3 个月大）、中期未受伤组织的整体压缩力学性能、老年（9 至 10 个月大）、老年（18 至 20 个月大）和非常老年（24 至 28 个月大）的动物。因为 TA 肌肉没有表现出随年龄显着不同的体积压缩机械性能，所以根据本研究的目标临床人群选择用于进一步实验的动物年龄。具体来说，本研究使用了 20 到 22 个月大的老鼠，它们大致相当于 60 到 75 岁的人类，他们将从机器人辅助的机械疗法中受益。这一选择是根据 22 个月以上动物的有限可用性进一步选择的。当前研究的其他加载参数（频率、占空比和负载曲线）选自先前使用的 ML 参数范围。在幼年动物中，经过 14 天的治疗后，ML 治疗导致强直收缩力和收缩速度显着高于未治疗的对照组。然而，这些对肌肉功能的有益影响并没有随着年龄的增长而保留下来。治疗 21 天后，老年动物在 ML 治疗组和未治疗组之间没有观察到肌肉功能的显着差异，引起的收缩力和速度仍然显着低于受伤的年轻肌肉。在整个研究期间（总共 21 天），接受 ML 治疗的受伤老年肌肉仅达到未受伤老年肌肉力量和速度的约 20%。

图2 仅由机器人驱动的 ML 不会对受伤后的老化肌肉产生积极的治疗效果

由于肌肉干细胞的激活、增殖和分化对于肌肉再生的发生至关重要，接下来本研究评估了衰老干细胞在受伤后对 ML 的反应行为。14 天内表达 Pax7+ 的细胞总数在受伤后 3 天的受伤、未治疗的老年肌肉（对照）中最高，随后下降。然而，ML 处理的肌肉在第 7 天的 Pax7+ 群体中表现出较晚的峰值，到第 14 天，ML 处理组中的总 Pax7+ 细胞仍然显着较高，而对照组几乎趋于未受伤水平这一基准（图 3）。为了确定循环 Pax7+ 细胞的百分比，本研究使用增殖标记 Ki67 进行了共染色。在第14天，与对照组相比，ML治疗的老年肌肉中 Pax7+ 细胞的百分比也显着更高，对照组在该时间点不再表现出循环 Pax7+ 细胞。这些发现与图 3中的数据一致，图 3显示在第 14 天，与对照组相比，ML 处理的肌肉中 Pax7+ 细胞数量仍然较高。因为损伤后观察到的大多数 Pax7+ 细胞是开始肌生成的 MPC，本研究量化了表达 MyoD 的 Pax7+ 细胞部分，MyoD 是一种成肌细胞决定蛋白，可发出活化干细胞的肌源性承诺信号。Pax7+/MyoD+ 双阳性细胞也在受伤后 3 天早期达到峰值，表明 MyoD 转录因子的早期表达，表达这两种标记的细胞比例随后在 ML 治疗组和对照组中均下降。然而，在第3天，对照组中明显更高比例的 Pax7+ 细胞是 MyoD+，随后下降更快，导致到第7天，与 ML 处理组相比，对照组中这些双阳性细胞的比例显着降低。到第14天时，两组中都很少有 Pax7+ 细胞能够表达 MyoD。因为已知成肌细胞向肌细胞的转化通常伴随着肌细胞生成素 (MyoG) 的表达，所以本研究量化了表达 MyoG 的细胞的数量。在整个 14 天的治疗中，与 ML 治疗组相比，在对照组中观察到更多数量的 MyoG+ 细胞，在第 3 天和第 14 天有显着差异。到第 14 天时，与 MyoG+ 细胞相比，对照肌肉的 Pax7+ 细胞数量减少了 3.8 倍，而在同一时间点，在 ML 处理的肌肉中，这些细胞群之间没有观察到差异。这些数据表明，在用 ML 治疗的受伤老年肌肉中，Pax7+ MPC 转化为终末分化 MyoG+ 肌细胞的过程有所延迟。

图3 ML 对老年骨骼肌中 MPC 的再生的破坏

为了评估 ML 对严重肌肉损伤后老年炎症反应的影响，本研究首先使用流式细胞术分析量化受损组织内的总免疫细胞和特定免疫细胞亚群。在本团队之前的工作中，用 ML 治疗受伤的年轻肌肉导致受伤后3天组织中性粒细胞显着减少，因此，本研究进一步将这种中性粒细胞清除与在年轻动物中观察到的功能改善联系起来。在这里，观察到受伤的老年肌肉在 14 天的 ML 治疗中没有表现出组织中性粒细胞数量或动力学的任何变化（图 4）。此外，总衰老免疫细胞 (CD45+)、衰老巨噬细胞 (CD45+/CD11b+/F4/80+) 或衰老树突细胞 (CD45+/CD11b+/CD11c+) 的细胞数量或动力学没有变化。在受伤的老年肌肉中，巨噬细胞亚型（M1、M2a 和 M2c）同样不受 ML 治疗的影响。本研究接下来关注了广泛的细胞因子和趋化因子的表达，并将它们的相对表达确定为 ML 治疗组与未治疗对照组的比率。本研究观察到，在受伤的年轻肌肉中，ML 在 14 天的治疗中促进了许多促炎标志物的下降。然而，在受伤的老年肌肉中观察到相反的趋势，其中 ML 产生大多数细胞因子的增加，其中几种表现出从第3天到第 14 天表达增加的趋势。本研究通过评估 ML 处理动物血清中同一组炎症标志物的表达，证实这种效应是 ML 处理肌肉的局部效应。对年轻肌肉和老年肌肉中显着改变的因子（ML 至少上升或下降 50%）的基因富集分析表明，年轻肌肉中显着减少的标记物主要通过 CCR 等机制参与驱动炎症级联反应和 CXCR 结合或细胞因子的产生，以及介导免疫细胞趋化性。相反，在老化的肌肉中，许多相同的标记物随着 ML 而显着增加。本研究更仔细地检查了几种促炎标志物，并观察到在接受治疗的受伤老年肌肉中干扰素-γ (IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α (TNFɑ) 和白细胞介素-6 (IL-6) 的 mRNA 和蛋白质水平均有所增加ML 与受伤、未治疗的对照相比。还在受伤动物（对照或 ML 处理）的对侧肢体（未受伤、未治疗的肢体）中分析这三种促炎标志物的表达，以确定这些细胞因子的基线水平，并评估任何潜在的系统变化以响应 ML 应用于受伤的肢体。

图4 损伤后老年肌肉和年轻肌肉中的免疫系统受 ML 的不同调节

为了检验 ML 诱导的老年肌肉炎症干扰再生的假设，本研究通过全身施用 GC 曲安奈德 (TAc) 引入了抗炎治疗和 ML 治疗（图 5）。在治疗 14 天后，首先检查了同一组细胞因子和趋化因子。将每日 GC 给药与 ML 相结合，通过减少受伤组织中几种炎症标志物的表达，减轻了 ML 诱导的老年肌肉炎症，其中许多在ML + GC处理的老化肌肉中的表达水平与仅用ML治疗的年轻肌肉相似。对标记物进行基因富集分析，这些标记物在用 ML 治疗的受伤老年肌肉中至少上升 50%，但当 ML 与 GC 治疗组合时下降至少 50%。该分析揭示了涉及免疫细胞趋化性、促炎细胞因子产生和趋化因子活性的关键途径，其中许多途径在仅用 ML 治疗的受伤年轻肌肉中同样下降。本研究还评估了 GC 仅在恢复期间对老年肌肉炎症的影响，并与仅 ML 和 ML + GC 治疗进行了比较。富集分析揭示了 GC-only 和 ML + GC 组共有的几个炎症过程，以及一些 GC-only 独有的炎症过程。另外，本研究发现：结合 ML 和 GC 治疗受伤的老年肌肉降低了促炎标志物 IFN-γ 和 TNFɑ 的 mRNA 和蛋白质表达水平，这些标志物在受伤后长期存在已被证明会阻碍肌肉再生。

图5 GC 治疗可改善 ML 诱导的衰老肌肉炎症

本研究接下来评估了老年肌肉干细胞响应 ML + GC 联合治疗的行为。14 天后，与仅 ML 组相比，仅 GC 组和 ML + GC 组的 Pax7+ MPC 水平显着降低（图 6），Pax7+/MyoD+ 细胞数量也明显减少。此外，与仅 ML 相比，仅 GC 和 ML + GC 组中 eMHC+ 肌纤维的百分比有所降低。与 ML-only 相比，在 ML + GC 组中观察到主动分化肌原性前体减少和未成熟 eMHC+ 肌纤维数量减少同时出现更大、更成熟的肌纤维，这由肌纤维大小直方图向右移动表明分布。另外，与仅 ML 而不是 ML + GC 相比，仅 GC 治疗导致更成熟的肌纤维分布，这表明联合治疗比单独 GC 治疗在促进衰老肌肉再生方面更有效。用 ML + GC 治疗的老年肌肉的炎症减少、灌注增加、坏死减少和生肌分化改善促使本研究评估 ML 在 GC 介导的炎症控制存在下是否可以改善严重损伤后的老年肌肉功能。治疗 7 天后，本研究观察到与未治疗的对照组和仅接受 ML 治疗的肌肉相比，仅 GC 组和 ML + GC 组受伤的老年肌肉的收缩力都有显着改善。到第 14 天，ML + GC 组表现出比所有组（包括仅 GC）更高的平均收缩力和速度。此外，ML 在细胞水平上的作用仍然很明显，因为无论是否引入 GC 治疗，ML 都发现 YAP 和 MRTF-A 上升。总之，这些发现表明老年炎症反应在损伤后老年骨骼肌再生中的抑制作用，以及通过炎症控制减轻机器人驱动的 ML 对老年肌肉再生的负面影响的潜力。

图6 将 ML 与 GC 介导的炎症控制相结合可改善老化肌肉的再生结果

2. 总结与展望

总之，这项研究揭示了严重损伤后骨骼肌对机器人驱动的 ML 反应的重要年龄依赖性差异，并揭示了 ML 对老年肌肉再生的多重负面影响。使用炎症控制来指导老年肌肉恢复对 ML 的反应是一个潜在的强大概念，其与老年患者群体的临床研究高度相关。尽管 GC 治疗可能伴随一系列潜在的副作用，但在这项工作中使用GC提供了概念证明。进一步的研究应侧重于使用更有针对性的药理学辅助与 ML，以及更深入地评估 ML 在衰老肌肉中的负面作用。老年创伤是一个从机器人辅助组织再生技术中受益匪浅的医学领域。这项工作证明了使用与年龄相关的生物变化的药物控制作为基于机器人的治疗的辅助手段的重要性，可以利用在老年人的年轻组织中观察到的再生机器人的价值。