【原】PIEZO2活动解析：揭示周围神经系统的感觉机制

脑声常谈 2023-06-23 发布于上海

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2023年6月16日美国斯克里普斯研究所神经科学系Kara L. Marshall研究团队在Neuron杂志上发表文章“Labeling PIEZO2 activity in the peripheral nervous system”，揭示了使用FM 1-43标记周围神经系统中的PIEZO2活动，进而表征体内机械感觉过程。

感觉神经元检测来自环境和内部器官的机械力以调节生理机能。PIEZO2是一种机械感觉离子通道，对于触觉、本体感觉和膀胱牵拉感至关重要，但其在感觉神经元中的广泛表达表明它具有尚未发现的生理作用。为了充分理解机械感觉生理学，必须知道表达PIEZO2的神经元何时检测到。荧光苯乙烯基染料 FM 1-43被证明可以标记感觉神经元。作者发现小鼠体内绝大多数FM 1-43体感神经元标记依赖于周围神经末梢内的PIEZO2活性。通过使用FM 1-43识别与排尿相关的新型表达PIEZO2的尿道神经元来说明FM 1-43的潜力。这些数据表明，FM 1-43是通过体内PIEZO2激活进行机械敏感性的功能性探针，并将促进多器官系统中已知和新型机械感觉过程的表征。

图一 FM 1-43感觉神经元的大部分摄取取决于Piezo2的表达

在 HoxB8Cre鼠的尾部DRG中几乎没有广泛标记的DRG细胞体；DRG标记显示HoxB8Cre鼠中荧光的梯度下降；FM 1-43在脉管系统中经常可见，然而，这种血管标记会在24小时后减少，并且可能反映了内皮细胞的内吞活性和/或内皮腔外叶的标记。作者还从动物从结状神经节中去除功能性Piezo2，结状神经节通过迷走神经向身体的主要器官提供感觉神经支配。KO动物中几乎不存在结状神经元细胞体标记，Phox2bCre靶向的相邻颈静脉神经节中的标记仍然存在。总之，这些数据表明大多数FM 1-43感觉神经元标记依赖于PIEZO2表达。机械转导位点位于外周感觉神经元末梢，远离背根神经节和结状神经节的细胞体。除了感觉神经元细胞体之外，体内注射FM 1-43还可标记外周感觉末梢。为了研究结状神经节提供的感觉末梢，作者探究了环绕主动脉中央弓的压力感受器末梢以检测血压。有研究表明，PIEZO2阳性传入神经元只是支配主动脉弓的神经元的一个子集。作者发现FM 1-43标记主动脉弓神经元的一个子集，FM 1-43标记的还发生在毛状皮肤的皮肤终末器官结构中，该结构围绕毛囊来检测各种刺激方式并最终传达触觉。

图二 FM 1-43的DRG细胞类型的特征

使用有髓Ab和Ad低阈值机械感受器(LTMR)的标记，作者发现50.6% ± 9.7% 的NFH阳性DRG占用FM 1-43的68.3% ± 5.2%。表达钙结合蛋白的神经元积累FM 1-43。高达 95% ± 3%的酪氨酸羟化酶群体（无髓鞘c-LTMR的标记）与FM 1-43共标记。这表明FM 1-43标记了大部分无害的机械感受器，这些感受器依赖于PIEZO2来传达触觉。PIEZO2 转录本也在一些伤害感受器中被发现，这可能有助于FM 1-43的积累。为了标记肽能和非肽能伤害感受群体，对原肌球蛋白受体激酶A (TRKA)、降钙素基因相关肽(CGRP)和异凝集素进行了染色。在FM 1-43标记的神经元中，观察到与肽能伤害感受器的低重叠。PIEZO2在健康组织中的主要作用是传递无害的机械感觉而不是疼痛。这些结果表明PIEZO2依赖性FM 1-43标记与参与PIEZO2活动而非简单表达模式的神经元类型重叠。

图三 FM 1-43在皮肤终末器官结构中的摄取

作者观察到用NFH29标记的有髓末端经常重叠；45%FM染料信号与NFH重叠，在总NFH信号中，51%与FM 1-43重叠。作者对Ab RA-LTMR、锥形和保护毛囊周围的纵向披针形末端进行染色，发现25%的总钙结合蛋白信号与FM 1-43重叠。除了 LTMR，毛囊还接受来自环周高阈值机械感受(HTMR)末梢的神经支配，这些末梢对疼痛刺激做出反应。还发现FM 1-43标记的边缘部分与CGRP共定位（约2.5%），并且不到1%的CGRP信号对FM 1-43呈阳性。FM 1-43标记有时是斑点或间歇性的，可能导致低估与更连续的标记（如NFH或钙结合蛋白）的实际重叠。这些结果表明FM 1-43在多毛皮肤中标记了LTMR。TSC在其基部紧紧包裹着披针形和圆周末端。为了确定除了神经元之外，FM 1-43是否还标记这些细胞，作者对TSC标记物S100b进行了染色。尽管TSC细胞突起和神经元末梢的交叉使得标记难以区分，但发现没有明确标记的TSC细胞体。

图四 FM染料以活性依赖性方式标记皮肤终末器官结构，并且在辣椒素刺激后不标记表达TRPV1的神经元

作者认为去除腿部皮肤上的外部毛干会减少这些传入神经的机械激活，从而减少该区域的FM 1-43负荷。24小时后，剃光和脱毛后腿皮肤的披针形末端标记显著减少，而对侧对照的毛区域显示出明亮的标记。检查脱毛部位的边界，发现毛茸茸的皮肤上有披针形标记，紧邻未标记的脱毛皮肤。对背部皮肤的终末器官标记进行区域分析，扩展了对多毛皮肤标记模式的表征，它们作为通常存在于小鼠的触觉刺激的外部来源笼子。在这两种情况下，都观察到披针形末端的标记；作者使用CGRPCre+;GFP小鼠来识别大部分表达TRPV1的神经元。首先给小鼠注射FM 4-64，两小时后在后肢皮下注射辣椒素和逆行神经元示踪剂，以识别支配注射部位DRG神经元。后肢伤害感受器的标记很少见，发现用辣椒素未能产生可观察到的染料摄取变化。进一步证明了该工具在体内特异性标记PIEZO2依赖性神经元活动方面的实用性。

图五在细胞培养中，FM 1-43标记随着PIEZO2通道活动而增加

使用流式细胞仪对群体荧光进行定量显示，FM 1-43对过表达PIEZO2的细胞进行了标记，但对转染了对照质粒的细胞没有标记。作者对细胞进行轨道摇动作为简单的机械刺激，观察到标记增加了49% ± 8%，表明刺激依赖性摄取。对照细胞中的荧光在轨道摇动时没有变化，排除了单独刺激增加背景标记的可能性。与未受刺激的条件相比，机械刺激的PIEZO2R2686H表现出35% ± 10%的荧光增加。在有或没有机械刺激的情况下观察到荧光浓度依赖性减少，IC50值分别为115 ± 27和135 ± 31 mM。作者在FM染料存在的情况下对PIEZO1和 PIEZO2进行了一组电生理记录。表达PIEZO1的细胞的单通道电生理学表明PIEZO1和PIEZO2存在电压-依赖方式。

图六 FM 1-43揭示了雄性小鼠盆腔尿道中新颖的侧化感觉末梢

参与检测膀胱牵拉的神经末梢难以可视化，但与尿道相关的机械感觉神经元也有助于尿液反射。作者使用FM 1-43对LUT的调查揭示了一个新的群体男性盆腔尿道的神经元。这些具有树状形态的致密神经元末梢横跨整个外侧尿道区域。这些神经元末梢未能在HoxB8Cre+;Piezo2f/f小鼠中标记，表明它们的标记取决于PIEZO2。在男性和女性的远端尿道中也观察到形态上不同的神经元末梢，外形类似于简单的游离神经末梢。

图七树状尿道神经元末梢的特征

在阐明这些树状尿道神经元分子特征中，作者使用整体免疫染色和基因报告小鼠将FM染料标记与神经元标记共定位。尽管泌尿道有致密的肽能神经支配，但这些神经元末梢不是CGRP阳性。作者还发现树状尿道神经元几乎全部为NFH阳性，表明这些是可能源自DRG的中等到大直径的神经元。免疫标记并未延伸到神经末梢。因此，复杂的末端形态完全由染料解析，展示了使用FM 1-43进行神经元定位的优势。此外，作者使用相同的免疫染色策略证实这些结构仍然存在于HoxB8Cre+;Piezo2f/f KO动物中，表明FM染料标记的缺乏是由于PIEZO2的缺失，而不是这些神经末梢的发育损失。尿道神经元标记在填充1小时后很明显，而在未填充的情况下几乎不存在。这表明排尿是参与尿道神经元中PIEZO2依赖性神经元活动的相关刺激。