在187例社区获得性肺炎(CAP)患儿中，158例被诊断为MPP，29例被诊断为细菌性或病毒性肺炎。158例MPP患儿中，MP RNA (MPR)阳性的患者有99例，MP特异性抗体(MPA)阳性的患者有51例，根据临床症状诊断为MPP(MPC)的患者有8例。患者的特征如表1所示，入组患者感染的微生物病原体见表S1。MPP患儿年龄大于对照组(7.8±2.9岁vs. 5.2±4.5岁)。研究人员使用逻辑回归比较MPP患儿和对照组患儿的临床表现，并将年龄作为协变量进行调整。森林图显示，MPP患儿出现发热(OR = 2.86, P = 0.015)、咳嗽(OR = 3.94, P = 0.028)、胸腔积液(OR = 3.44, P = 0.033)和凝血功能障碍(OR = 6.48, P < 0.001)的风险高于对照组(图1)。
图1. 森林图展示与对照组相比，与MPP相关的风险因素。优势比(OR)基于逻辑回归模型计算，并根据潜在的混杂因素(即年龄)进行调整。MPP，肺炎支原体肺炎患者；对照组，其他细菌性或病毒性肺炎患者；CI，置信区间。根据Shannon指数(图2(a)，P < 0.01)和Simpson指数(图2(b)，P < 0.001)的分析结果，MPP组的微生物群落多样性低于对照组。基于加权Unifrac距离矩阵并经PERMANOVA检验验证的PCoA显示两组间β多样性有显著差异(P = 0.001，图2(c))。研究人员还比较了两组在细菌门水平上的呼吸道微生物群组成。在对照组中，厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)是最占优势的细菌门，分别占总序列的47.9%和32.5%。而在MPP组中，软壁菌门(Tenericutes)的丰度显著增加，超过总微生物群的67%(图2(d))。研究人员对多变量分析得到的细菌分类群进行LEfSe分析，并采用Kruskal-Wallis秩和检验进行验证。LDA评分直方图排序结果表明，支原体(Mycoplasma spp.)在MPP组显著富集(图2(e))，占呼吸道微生物群的65%。除支原体外，链球菌(Streptococcus)和嗜血杆菌(Haemophilus)是下一个最丰富的细菌属，分别占MPP组肺部微生物群的6%和3%。在对照组中，链球菌和嗜血杆菌的丰度分别增加到41%和18%，是肺部微生物群中的优势菌株(图2(d))。
图2. MPP组与对照组呼吸道微生物群的比较。(A) 用Shannon指数评估α多样性。(B)用Simpson指数评估α多样性。(C) MPP组与对照组之间基于加权Unifrac矩阵的主坐标分析。(D)在门和属水平上呼吸道微生物群的相对丰度。(E)利用LEfSe分析两组间丰度差异显著的细菌物种。MPP组，肺炎支原体肺炎患者；对照组，其他细菌性或病毒性肺炎患者。** p < 0.01，*** p < 0.001。158例MPP患者中，57例(36.1%)为重度患者，101例(63.9%)为轻度患者。结果显示，重度MPP组呼吸道微生物群α多样性显著低于轻度MPP组(P < 0.01，图3(a,b))。重度组和轻度组的β多样性差异无统计学意义(P = 0.997，图3(c))。值得注意的是，在重度MPP患儿中，软壁菌门和支原体的丰度显著增加(图3(d,e))。此外，与轻度患儿相比，重度MPP儿童中嗜血杆菌的检出比例也更高。
图3. 对照组、重度MPP组和轻度MPP组呼吸道微生物群的比较。(A)用Shannon指数评估α多样性。(B)用Simpson指数评估α多样性。(C)基于加权Unifrac矩阵的主坐标分析。(D)在门和属水平上呼吸道微生物群的相对丰度。(E)利用LEfSe分析轻度MPP组和重度MPP组间丰度有显著差异的物种。MPP组，肺炎支原体肺炎患者；对照组，其他细菌性或病毒性肺炎患者。*** p < 0.001。2.3 基于不同诊断标准的MPP相关呼吸道微生物群研究人员还分析了通过不同诊断方法(即：MP RNA阳性(n = 99)、MP特异性抗体阳性(n = 51)、临床证据(n = 8))诊断的MPP患儿的呼吸道微生物群特征。三组间的α多样性(图4(a))和β多样性(图4(b))均无显著差异。同样，本研究还分析了三组之间的微生物群组成，也没有发现显著性差异。在三组中，软壁菌门和支原体分别在门(图4(c))和属(图4(d))水平上具有最高丰度。
图4. 基于不同诊断标准入组的MPP患儿呼吸道微生物群的比较。(A)用Shannon指数评估α多样性。(B)基于加权Unifrac距离矩阵的主坐标分析。(C)门水平呼吸道微生物群的相对丰度。(D)属水平呼吸道微生物群的相对丰度。NS，没有显著性差异。2.4 呼吸道微生物群分析有助于区分MPP和其他类型的CAP本研究分析了门、科和属水平上的微生物群组成，发现与对照组相比，MPP组的软壁菌门(0.08% vs. 67.20%，P < 0.001)、支原体科(Mycoplasmataceae，0.06% vs. 67.17%，P < 0.001)和支原体属(Mycoplasma，0.06% vs. 67.17%， P < 0.001)的平均丰度显著增加，表明它们在诊断MPP患儿方面的潜在价值(图5(a-c))。基于在属水平上支原体的截断值为0.126%，呼吸道微生物群的16S rRNA分析在区分MPP与其他类型CAP方面具有较高的敏感度(97.5%，154/158)和特异性(96.6%，28/29)，该模型的接受者操作特征(ROC)曲线下面积为0.994(图5(c))。基于OTU水平的全球微生物群组成分析表明，支原体是软壁菌门的优势属(附图2)。附表2展示了预测儿童MPP的软壁菌门、支原体科和支原体属的相对丰度的细节。有4例MP抗体滴度阳性的患儿被临床诊断为MPP。然而，使用本研究中基于微生物群组成的诊断模型和0.126%的支原体丰度截断值，这些患儿被重新分类为没有受到肺炎支原体感染，而是链球菌感染(n=2)或嗜血杆菌感染(n=2)(图6)，与细菌培养结果一致(附表3)。在这些儿童中，有3名患儿病程超过20天，在收集BALF样本时，所有儿童都接受了阿奇霉素治疗。
图5. MPP组和对照组软壁菌门、支原体科和支原体属的相对丰度。(A)软壁菌门。(B)支原体科。(C)支原体属。MPP，肺炎支原体肺炎患者；对照组，其他细菌性或病毒性肺炎患者。*** p < 0.001。
图6. 临床诊断与支原体丰度诊断不一致的患儿的呼吸道菌群的相对丰度(属水平)。研究人员还发现，重度MPP患儿比轻度MPP患儿更容易出现并发症(P < 0.001，附表4)。本研究分析了158例MPP患儿中支原体丰度与并发症数量的一致性(图7(a))，结果表明支原体丰度与并发症数量相关。本研究还分析了属水平呼吸道微生物群细菌丰度与不同疾病严重程度儿童临床指标之间的相关性(图7(b))。支原体丰度与HBDH和LDH水平呈正相关，表明重度MPP患儿肺炎支原体感染引发心血管损伤的可能性更高。此外，还观察到支原体丰度与TG和VLDL胆固醇水平呈正相关，支持了脂质代谢失调发生在重度MPP患者中的前提。综上所述，结果表明微生物群组成可能影响MPP的严重程度和进展。
图7. 微生物群与疾病严重程度之间的相关网络。(A)肺炎支原体丰度和并发症数量的一致性。(B)与轻度MPP相比，重度MPP患儿呼吸道微生物群属水平的细菌丰度与临床指标的相关性。本研究收集BALF样本，研究了MPP患儿的下呼吸道微生物群特征。由于收集下呼吸道样本的实际困难，因此很少有研究试图探索儿童下呼吸道的特征，这是主要的疾病部位。本研究数据表明，MPP儿童肺部的MP负荷和微生物群与上呼吸道不同。这项横断面研究描述了MPP患儿LRT菌群发生失调，并揭示了其与疾病严重程度的关系。现在已知健康个体的肺部栖息着相当多的细菌，并且已知这些细菌在慢性和急性肺部疾病期间发生改变。在健康肺部，厚壁菌门和拟杆菌门是最常见的细菌门。本研究表明，在MPP患儿的肺部，软壁菌门的丰度显著增加，超过整个菌群的65%。此外，MPP患儿呼吸道共生菌显著减少，以支原体属为主。基于OTU水平的整体微生物群组成分析表明，支原体占软壁菌门总OTU的99.99%。有研究表明，肺炎支原体可以通过直接竞争或激活细菌清除来减少其他呼吸道细菌。在健康个体中，LRT通过粘膜纤毛和免疫机制迅速清除存在的环境或上呼吸道细菌，以维持低水平的微生物群落。MP及其社区获得性呼吸窘迫综合征毒素能够诱导粘蛋白高分泌，从而导致MP局部复制增加。这种正反馈机制可能解释了本研究中观察到的支原体在MPP患者中的高丰度。最近有研究发现，呼吸道微生物组可预测多种肺部疾病的预后。本研究发现，与轻度MPP儿童相比，重度MPP患儿的LRT微生物群α多样性减少(α多样性是分类群数量及其分布均匀性的指标)。在本研究中，作者还发现MP丰度与疾病的严重程度具有相关性，包括并发症和器官损伤的特定血液指标。MP是血液相关疾病的病因，可导致心血管系统和胃肠道损害，包括MP相关性心肌炎、心包炎、肾炎和脑膜炎。先天免疫细胞对MP的识别及其随后的激活被认为是慢性炎症和一些重要MP感染症状和体征的主要原因。暴露于免疫细胞的MP数目是与免疫应答结果相关的最重要原因。MP的致病机制还包括直接损伤呼吸道上皮和免疫细胞，包括粘附损伤、侵袭性损伤、毒性损伤、炎症损伤和免疫损伤。因此，早期靶向治疗MP感染对于促进病原体清除和减少疾病相关损害具有重要意义。利用16S rRNA测序，还发现了支原体以外的共感染细菌病原体。链球菌和嗜血杆菌在MPP患儿中的相对丰度较高，表明这些病原体与支原体混合感染的风险较高，这与医院先前报道的研究结果一致。与轻度MPP患者相比，重度MPP患者中嗜血杆菌丰度显著增加，这可能是由于患者发生合并感染而促进了炎症反应并导致更严重的呼吸道疾病。因此，16S rRNA测序的另一个优势是能够分析整个呼吸道细菌微生物组，便于临床上对共感染病原体进行完整的诊断和靶向治疗。鉴别呼吸道感染病原体的标准微生物学方法包括从呼吸道样本中培养细菌。但是这种方法对于不可培养或培养不良的病原体(如肺炎支原体)的临床诊断价值有限。这表明，使用16S rRNA测序检测肺MP载量增加可能对MPP患儿具有诊断意义。近年来，疾病中的呼吸道微生物群落一直是一个研究热点。然而，很少有研究试图将肺部微生物组的变化与疾病诊断联系起来。在这项研究中，作者分析了LRT微生物群的变化，并构建了MPP诊断模型，该模型可有效区分MPP与其他类型的CAP。使用基于16S rRNA的诊断模型，成功检测出97.5%(154/158)的MPP儿童，其中包括NAAT阴性或血清学结果阴性的儿童。一般认为，免疫系统产生抗MP抗体的速度较慢，导致大部分MPP患儿入院时血清学结果为阴性。此外，抗体滴度可以在MP感染清除后持续很长时间，因此，可能由于先前的MP感染史而模糊当前感染的性质。在本研究中，四名儿童最初被诊断为合并感染，涉及MP(基于抗体阳性结果)和另一种细菌(基于培养结果)感染。然而，使用本研究的诊断模型，所有四名患儿都被诊断为仅由培养的微生物引起的当前感染。值得注意的是，BALF取样是一种侵入性取样方法，而且16S RNA测序相对耗时。BALF结果提示，16S rRNA基因测序在呼吸道样本传染病分析中具有潜在诊断作用，并可能扩展到痰液、鼻咽拭子等非侵入性标本。随着遗传分析技术的发展，MinION™纳米孔测序等最新技术可能会克服NGS耗时长的缺点。一般来说，本研究中建立的诊断模型仅限于具有可以进行柔性支气管镜检查的适应症的儿童。本研究存在一些局限性。首先，本研究收集了BALF样本，痰液和BALF样本是更常用的LRT微生物组取样方法。作为一种非侵入性的样本类型，这种方法可以连续收集自发性和诱导性痰样本，但这种样本是上呼吸道和下呼吸道生物混合物。尽管BALF受污染的影响比痰液小，但该方法需要侵入性操作，这阻碍了其在常规呼吸道微生物群分析中的应用。因此，目前的BALF数据仅限于那些将支气管镜检查作为其临床护理的一部分的受试者。因此，本研究没有健康对照组的数据。其次，本研究的样本量相对较小。未来，有必要进行大规模队列研究来证实本研究的发现。例如，虽然本研究在6名MPP患儿和5名对照组患儿中检测到病毒感染，但由于样本量有限，本研究未分析病毒感染对呼吸道微生物群的影响。第三，16S rRNA基因图谱无法区分活菌和死菌。细菌被杀死后，它们的DNA序列可能会持续几天甚至更长时间。因此，16S rRNA基因图谱不能反映微生物群的活性。活细菌和死细菌都可以通过产生代谢产物和模式识别受体来调节免疫功能。因此，需要进一步研究活细菌和死细菌在感染性疾病期间诱导炎症中的作用。第四，与现有的实时PCR等方法相比，16S rRNA基因测序的成本仍然很高，难以在一般情况下应用。该方法可能在某些特殊情况下，例如在具有非典型临床表现的严重MPP病例中，能够同时识别其他致病菌，从而突显出这种方法特殊的便利性。综上所述，本研究表征了肺炎支原体肺炎患儿下呼吸道菌群的特征，并揭示了其与疾病严重程度的关联。本研究结果表明，下呼吸道中高丰度的肺炎支原体可能有助于MPP的诊断。未来，需要大规模的前瞻性研究来确定本研究构建的诊断模型的有效性，并充分探索所观察到的相关性的机制。
