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自闭症谱系障碍(ASD)是一组不同神经行为异常的总称，包括对社会互动和沟通的兴趣降低，刻板行为，限制的兴趣和行为增加等行为表现。先前的研究已经确定了数百个与自闭症相关的基因。其中许多基因编码突触前和突触后结构域的突触蛋白，包括Shank3、神经素、神经素、钙粘蛋白和神经递质受体，这表明ASD中突触和神经传递病理生理的显著趋同。参与ASD发病的最常见的神经递质是兴奋性谷氨酸能神经递质。ASD患者纹状体中谷氨酸浓度降低，与社交症状的严重程度相关。最近大量研究表明，在ASD患者或动物模型的大脑中，谷氨酸受体和转运蛋白的表达水平异常。 尽管越来越多的证据表明谷氨酸异常信号通路已被提出，但对谷氨酸代谢和体内平衡所涉及的酶的改变所知甚少。谷氨酰胺酶1 (GLS1)是一种催化谷氨酰胺水解为谷氨酸的酶，在大脑中谷氨酸的生成中起着关键作用。最近的临床研究表明，GLS1基因功能丧失与神经发育障碍有关。例如，GLS1突变或者shRNA导致GLS1表达的缺乏或完全敲除的功能缺失，进而介导了人类痉挛性共济失调、视神经萎缩、癫痫以及运动和语言技能的丧失。此外，还发现ASD患者死后前扣带皮层GLS1表达水平降低。但是，GLS1功能障碍是否会诱导ASD样行为表型，以及相关的突触损伤及机制目前尚未明确。 在此背景下，2023年06月28日同济大学医学院附属同济医院神经变性与再生治疗中心郑加麟和齐薪蕊课题组共同在Cell Reports发文揭示了谷氨酸能神经元的GLS1缺乏导致自闭症谱系障碍样行为的分子机制。
首先，课题组在数据库里对外周血白细胞、淋巴细胞的GLS1基因的富集（GSE）分析提示：与对照组相比，ASD患者的外周血的白细胞、淋巴细胞GLS1的mRNA的表达减少。ASD患者死后的额叶皮层、颞叶皮层组织的GLS1的mRNA的表达减少。但是与正常相比，在ASD患者死后的枕叶皮层、小脑、胼胝体组织的GLS1的mRNA的表达无明显变化。这组生信分析通过人体样本表明：自闭症谱系障碍可能与脑组织中的GLS1表达水平有关。
图1.ASD患者外周血和脑组织GLS1表达降低 课题组将CamKIIa-Cre的小鼠（前脑谷氨酸能神经元中特异表达Cre重组酶）和Gls1flox/flox杂交，就可以得到在谷氨酸能神经元上携带CRE重组酶并且Gls1单敲的CamKIIa-Cre、Gls1+/flox的小鼠。将CamKIIa-Cre、Gls1+/flox小鼠再进行杂交，就可以得到前脑谷氨酸能神经元中特异表达Cre重组酶并且Gls1未敲除的纯合子小鼠（Control小鼠）、表达Cre重组酶并且在前脑谷氨酸能神经元上Gls1单敲的杂合子小鼠（Gls1CamKIIa-Cre小鼠，双敲后小鼠不易存活）。课题组取Gls1CamKIIa-Cre和Control小鼠的海马（HIPP）和前额叶皮层(PFC)组织分别进行qRT-PCR、WB、LC-MC(液质联用)实验，检测Gls1在转录水平和翻译水平的变化，以及谷氨酸盐在组织中的含量。结果显示：Gls1CamKIIa-Cre小鼠的Gls1在HIPP和PFC中转录和翻译水平减少，并且谷氨酸盐的含量减少，这组实验表明：Gls1CamKIIa-Cre小鼠构建成功。
图2.Gls1CamKIIa-Cre小鼠的表征 然后，为了了解Gls1CamKIIa-Cre小鼠是否出现自闭症谱系障碍样行为。课题组进行了一系列自闭症相关的三箱社交、筑巢、理毛、挖掘、大理石掩埋、水迷宫、前脉冲抑制等行为学检测。结果显示：与对照组相比，Gls1CamKIIa-Cre小鼠新奇社交时间减少，筑巢评分减少，刻板运动（筑巢、理毛、挖掘）增多，大理石掩埋增多，水迷宫找到平台的时间延长，前脉冲抑制减弱。这组实验表明：Gls1CamKIIa-Cre小鼠出现新奇社交缺陷、刻板行为、学习记忆下降、感觉运动门控受损。
图3.Gls1CamKIIa-Cre小鼠出现社交缺陷、刻板行为、学习记忆受损和感觉运动门控缺陷 课题组进一步电生理检测Gls1CamKIIa-Cre小鼠的mPFC脑区的兴奋性突触后电位（mEPSC）和抑制性突出后电位(mIPSC)的放电频率和幅度。结果显示：与对照组相比，Gls1CamKIIa-Cre小鼠mPFC脑区的mEPSC的放电幅度降低；mIPSC的放电频率降低，并且这种电生理变化现象可以被脂多糖（LPS）所翻转。Gls1CamKIIa-Cre小鼠mPFC脑区的神经元个数正常，但树突棘增多。电镜下观察到Gls1CamKIIa-Cre小鼠mPFC的囊泡数量减少，突触后致密部（PSD）的厚度和长度降低。这组实验说明：与对照组相比，Gls1CamKIIa-Cre小鼠mPFC突触神经传递减少、树突棘密度增高、突触超微结构（PSD的厚度和长度降低）异常。
图4.Gls1CamKIIa-Cre小鼠mPFC突触神经传递、树突棘密度和突触超微结构异常 为了进一步探究Gls1介导的PFC脑区突触结构功能缺陷和自闭行为改变的分子机制，课题组对小鼠的PFC组织进行了RNA测序(RNA-seq)，并进行了转录组分析。分析出了Gls1CamKIIa-Cre小鼠PFC脑区和自闭症相关基因（NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、AMPAR1、mGluR5、GABAR1、GABAR2）的在转录水平明显升高。课题组进一步取脑组织进行翻译后水平的验证，和测序结果一致。这组实验表明：Gls1CamKIIa-Cre小鼠PFC脑区和自闭症相关基因表达水平升高。
图5.Gls1CamKIIa-Cre小鼠PFC脑区和自闭症相关基因表达水平升高 Gls1CamKIIa-Cre小鼠的树突棘的密度增加要么是由于突触的形成增多，要么是突触的消除减少，突触的形成和消除叫做突触修剪，而突触修剪是小胶质细胞调节的。Gls1CamKIIa-Cre小鼠和对照组小鼠的PFC组织的RNA测序筛选出了与突触修剪相关6个基因转录水平下降。课题组取Gls1CamKIIa-Cre小鼠的mPFC组织做qRT-PCR进行了验证，和测序结果一致。 为了进一步探究小胶质细胞是如何影响Gls1CamKIIa-Cre小鼠的突触修剪的，课题组取Gls1CamKIIa-Cre小鼠的mPFC组织做了单细胞核测序（snRNA-seq），聚类分析找出了5种不同的小胶质细胞亚型，以及每种小胶质细胞亚型的标记基因。在所有亚型中，第2种小胶质细胞亚型中参与突触修剪相关过程（吞噬、内吞作用、迁移以及溶酶体和溶酶体运输）的基因显著上调，这表明第2种亚型的小胶质细胞可能是Gls1CamKIIa-Cre小鼠突触修剪减少的原因。课题组取Control、LPS处理的Control小鼠、Gls1CamKIIa-Cre小鼠、LPS处理的Gls1CamKIIa-Cre小鼠的PFC的组织做qRT-PCR，发现和Control小鼠相比，与突触修剪相关3个基因（C1qa、C1qb、C1qc），在Gls1CamKIIa-Cre小鼠C1qa、C1qb、C1qc转录水平明显降低，但给予LPS处理后的Gls1CamKIIa-Cre小鼠，C1qa、C1qb转录水平又有所升高。 免疫荧光结果显示：Gls1CamKIIa-Cre小鼠的小胶质细胞的个数和胞体的大小并无明显的变化。但是与对照组相比，Gls1CamKIIa-Cre小鼠的小胶质细胞纤维丝的长度缩短，被包围的突触后小点数目均降低，并且这种现象可以被LPS处理所翻转。在行为学上进一步验证结果也是一致的：Gls1CamKIIa-Cre小鼠出现新奇社交缺陷（三箱社交中新奇社交时间减少）、刻板行为（旷场中总的运动距离增加），但是这种行为学现象可以被LPS处理所翻转，即：LPS给药后的Gls1CamKIIa-Cre小鼠三箱社交中新奇社交时间增多，旷场中总的运动距离下降。这组实验从分子、行为学水平探究了低剂量LPS可挽救Gls1CamKIIa-Cre小鼠的异常小胶质突触修剪和行为障碍的机制。
图6.低剂量LPS可恢复Gls1CamKIIa-Cre小鼠的异常小胶质突触修剪和行为障碍 综上所述，本文为了阐明GLS1在ASD病理过程中的作用，分析了数据库里转录组数据。与对照组相比，不同队列的ASD患者外周血或死后大脑中GLS1的转录水平降低。在死后人脑研究中，ASD与GLS1的前脑显性缺失有关，而且GLS1在谷氨酸能神经元中特别表达，因此选用前脑谷氨酸能神经元Gls1缺乏的条件转基因小鼠(Gls1CamKIIa-Cre小鼠)，以实现Gls1在大小和分布上的相似减少。行为学验证了这种特异性的Gls1缺失导致ASD相关行为缺陷，同时伴随着树突棘密度、突触神经传递、超微结构以及前额叶皮质(PFC)突触相关基因表达的变化。而且，这种异常与PFC中特定小胶质细胞亚型的突触修剪能力下降有关，低剂量脂多糖(LPS)治疗可改善Gls1CamKIIa-Cre小鼠的小胶质细胞突触修剪能力，进而恢复功能失调的突触神经传递和社会互动缺陷。 文章来源：https:///10.1016/j.celrep.2023.112712 |
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