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今天来和大家聊聊原料药中杂质的相关研究进展 摘要：药物中存在的无治疗作用或影响药物稳定性和疗效、对人体健康有害的物质,即任何影响药物纯度的物质统称为杂质。规范地进行杂质的研究,并将其控制在一个安全、合理的限度范围之内,直接关系到上市药品的质量及安全性。原料药杂质研究目的:通过系统地研究杂质情况,选择合适的分析方法,准确分辨、测定杂质含量,并综合药学、药理、毒理及临床研究的结果,确定杂质的合理限度;为提高生产水平,实现原料药合成反应监控,中间体纯度控制及合成工艺的优化,制剂的处方、制备工艺及包装的优化确定提供支撑;为药品贮存条件及有效期的预测提供依据;最终达到保证临床用药安全有效的目的。 一、杂质的分类 药品中的杂质按其化学类别和性质一般分为三类:有机杂质、无机杂质及残留溶剂。按照其来源,杂质可以分为工艺杂质(包括合成中未反应完全的反应物及试剂、中间体、副产物等)、降解产物、从反应物及试剂中混入的杂质等。按照其毒性分类,可分为毒性杂质和普通杂质等。杂质还可按其化学结构分类,如几何异构体、光学异构体、其他甾体、其他生物碱、其他氨基酸和聚合物等。 一般主要按照杂质的化学类别和性质分类： 1.有机杂质 包括工艺中引人的杂质和降解产物等，可能是已知的或未知的、挥发性的或不挥发性的。由于这类杂质的化学结构一般与终产物类似或具渊源关系,故通常又统称为有关物质 2.无机杂质 是指在原料 药生产或传递过程中产生的杂质,这些杂质通常是已知的，主要包括:反应试剂、配位体、催化剂、重金属、其他残留的金属、无机盐、助滤剂、活性炭等 3. 残留溶剂 是指在原料 药生产过程中使用的有机溶剂。原料药制备工艺中可能涉及的残留溶剂主要有三种来源 合成原料或反应溶剂、反应副产物、由合成原料或反应溶剂引入。其中作为合成原料或反应应溶剂是残留溶剂的主要来源。 二、原料药杂质的分析方法 根据药物及杂质的理化性性质、化学结构、杂质的控制要求等确定适宜的检测方法。给大家制作一张图总结记忆
图.1-杂质检测技术路线图 (一)有机杂质的分析方法 有机杂质的检测方法包括化学法、光谱法、色谱法等,通过合适的分析技术将不同结构的杂质进行分离、检测,从而达到对杂质的有效控制。分析方法的主要指标是能够区分相关的化合物。通常使用的方法是将分离(提取)与检测和定量(光谱)方法串联进行。 目前普遍采用的杂质检测方法主要为高效液相色谱法(HPLC)、薄层色谱法(TLC)气相色谱法(GC)和毛细管电泳法(CE)。 ★HPLC 是杂质检测最常使用的方法。 ★TLC 法可用来分离大量的物质,TLC法主要的不足在于分辨和检测能力有限,以及定量能力较弱。 ★气相法能够提供较好的分辨、检测以及定量能力,但是样品必须是可挥发性的。 ★毛细管电泳对于分析微量样品,以及对分辨力要求较高时相当有用。随着技术的发展,目前已有许多高专属性及更精确分离的方法用于杂质检测,极大地改善了对批量原料药分析测定的评价。 由于杂质类型多样,每种分析方法也都有各自的局限性,所以在进行杂质研究时,应注意不同原理的分析方法间的相互补充与验证,如HPLC与TLC及HPLC与CE的互相补充,反相HPLC系统与正相 HPLC 系统的相互补充,HPLC 不同检测器检测结果的相互补充等。 光谱方法包括紫外(UV)、红外(IR)、核磁共振(NMR)以及质谱(MS)。单一波长紫外光谱分析方法提供的选择性非常有限,而使用二极管阵列检测器则能在各种波长下提供更充分的信息以保证方法具有更高的选择性。红外光谱能对某些官能团显示特定的信息，可以进行定量分析,并具有选择性。核磁共振能够提供分子结构很精细的信息，是产品及有关杂质定性研究非常有用的方法。质谱所需的样品量非常少，能在大量离子碎片结构的基础上提供良好的结构信息。 (二)无机杂质的分析方法 对于无机杂质，各国药典都收载了经典、简便而又行之有效的检测方法。对于新药,建议采用离子色谱法及电感耦合等离子发射光谱-质谱(ICP-MS)等分析技术,对产品中可能存了在的各类无机杂质进行定性、定量分析,以便对其生产工艺进行合理评价,并为制定合理的质量标准提供依据。 通常情况下,不挥发性无机杂质采用炽灼残渣法进行检测。某些金属阳离子杂质(银、铅、汞、铜、镉、铋、锑、锡、砷、锌、钴与镍等)笼统地用重金属限度检查法进行控制。因在药品生产中遇到铅的机会较多,且铅易积蓄中毒,故作为重金属的代表,以铅的限量表示重金属限度。如需对某种(些)特定金属离子或上述方法不能检测到的金属离子作限度要求,可采用专属性较强的原子吸收分光光度法或具有一定专属性的经典比色法(如采用药典已收载的铁盐、铵盐、硒等的检查法检测药品中微量铁盐、铵盐和硒等杂质)。虽然重金属检查法可同时检测砷,但因其毒性大,且易带人产品中,故需采用灵敏度高、专属性强的砷盐检查法进行专项考察和控制。 由于硫酸根离子、氯离子、硫离子等多来源于生产中所用的干燥剂、催化剂或pH调节剂等，考察其在产品中的残留量,可反映产品纯度,故应采用药典中的经典方法进行检测。如生产中用到剧毒物(如氰化物等),须采用药典方法检测可能引入产品中的痕量残留物。 对于药典尚未收载的无机杂质(如磷酸盐、亚磷酸盐、铝离子、铬离子等)的检测,可根据其理化特性,采用具有一定专属性、灵敏度等的方法,如离子色谱法、原子吸收分光光度法比色法等。 (三)残留溶剂分析方法 按有机溶剂的毒性和对环境的危害ICH将有机溶剂分为避免使用(第一类溶剂)、限制使用(第二类溶剂)、低毒(第三类溶剂)和毒性依据尚不足(第四类溶剂)四种情况。 (1)第一类溶剂(应该避免使用)及研究原则:第一类溶剂是指人体致癌物、疑为人体致癌物或环境危害物的有机溶剂。包括苯、四氯化碳、1,2-二氯乙烷、1,1-二氯乙烯、1,1,1-三氯乙烷5种溶剂。因其具有不可接受的毒性或对环境造成公害，在原料药辅料以及制剂生产中应该避免使用。如果工艺中不可避免的使用了第一类溶剂,则需要严格控制残留量,无论任何步骤使用,均需进行残留量检测。 (2)第二类溶剂(应该限制使用)及研究原则:第二类溶剂是指有非遗传毒性致癌(动物实验)或可能导致其他不可逆毒性(如神经毒性或致畸性)或可能具有其他严重的但可逆毒性的有机溶剂。包括乙腈、三氯甲烷、二氯甲烷、甲醇、甲苯、四氢呋喃等27种溶剂。 此类溶剂具有一定的毒性,但和第一类溶剂相比毒性较小，建议限制使用。考虑到第二类溶剂对人体的危害以及所使用的溶剂在终产品中残留的可能性，建议对合成过程中所用的全部第二类溶剂进行残留量研究,为最终制订合理可行的质量标准提供数据支持。 (3)第三类溶剂(药品GMP或其他质量求限制使用)及研究原则:第三类溶剂是Mp或其他质量要求限制使用,对人体低毒的溶剂。包括乙醇、丙酮、乙酸乙酯、异丙醇、乙酸27种溶剂。 第三类溶剂属于低毒性溶剂,对人体或环境的危害较小,人体可接受的粗略浓度限度为0.5%，建议对在终产品精制过程中使用的第三类溶剂进行残留量研究。 (4)第四类溶剂(尚无足够毒理学资料)的溶剂及研究原则:这类溶剂在药物的生产过程中可能会使用,但目前尚无足够的毒理学研究资料。包括1,1-二乙氧基丙烷、异辛烷、果丙醚、三氟乙酸等10种溶剂。残留溶剂的测定一般采用气相色谱法,此法所需的样品用量较少,基本可以满足所有残留溶剂测定的要求。推荐使用毛细管色谱柱-顶空进样系统,也可以使用普通填充柱,溶液直接进样方法。由于通常要同时检测多种溶剂,为操作的可行性和简便性,建议尽量采用同样的检测条件控制尽可能多种类的残留溶剂。在某些情况下，可以采用气相色谱法以外的方法进行残留溶剂的检查,如高效液相色谱法、毛细管电泳法、离子色谱法、气质联用、液质联用、干燥失重法等。 四、有机杂质的分离和鉴定研究 对有关物质的研究和控制的程度是创新药物质量研究水平高低的主要区分点。高水准的工作要求对有关物质有深人的研究,明确所有的杂质是工艺杂质还是降解产物，并进行一定性分析和定量控制,这对研究者是一大挑战。残留溶剂、无机杂质通常是已知的,比较容易定性、定量。工艺中引入的杂质和降解产物等,结构未必是已知的,含量又低,定性分析较难。 (一)杂质谱分析 分析起始原料中可能存在的杂质:起始原料对于药物中的杂质谱的种类具有决定作用通过对起始原料中杂质的分析,可以推测部分中间体及终产物中可能存在杂质的结构。 1.分析中间体杂质化学反应不可能实现100%的转化,上一步反应未转化的原料就可能成为后续反应乃至终产品中的杂质。 2.分析副反应及副反应产物化学反应往往会存在副反应,因此分析可能的副反应路线,就可以推测某些杂质的形成途径。分析副反应及副反应产物是推测终产品中杂质类型和结构的最为重要的途径之一。 3.推测降解产物通过对药物分子中不稳定基团和活泼基团的分析可以初步推测药物的降解途径和降解产物。 通过杂质谱分析,对药物的杂质类型有一个初步的了解,可以为后续的测定提供重要指导。 (二)有机杂质的分离和鉴定研究 采用色谱、光谱及其联用技术等,对药物中具有代表性和特征性的杂质进行研究。首先可探索通过各种强制降解试验刻意增加某些杂质的量,也可在合成研究中模拟最差工艺条件进行合成,以获得尽可能多的杂质进行下一步的研究工作。 可采用HPLC峰保留时间对比法进行杂质鉴定，即取预测的已知化合物与含杂质的药物,在同样的色谱条件下看已知化合物与该杂质的保留时间是否一致。利用二极管阵列检测器,观察拟定性有关物质的紫外吸收情况,并测定该杂质的最大吸收和最小吸收的数据。初步确定该杂质结构中可能存在的官能团,也可以与已知化合物进行紫外吸收情况的对比为有关物质结构的最终确定提供有用信息。液质联用和气质联用是获得杂质信息的有效手段可以获得各个杂质的可能分子量,或进一步通过多级质谱获得各杂质的裂解情况,为解析化合物的结构提供直接证据。LC-IR和LC-NMR等联用技术也有应用。 (三)有机杂质的制备 由于所分离制备的对象为样品中的微量杂质,其含量通常是主化合物千分之几,结构和性质通常又与主成分很相似,为获得完整的杂质信息,需要获得毫克到克级的纯杂质样品，以便后续研究使用。 1.色谱法制备杂质有关物质可通过制备HPLC法，制备TLC法、超临界流体色谱、逆流色谱等获得，当有关物质的量较大或与主成分分离情况较好时,还可以采用柱分离的方法或改变结晶条件的方法获得。 液相制备色谱是制备杂质的有效手段,主要的考虑因素是目标产物的纯度、产量、生产周期、运行成本等。超临界流体制备色谱兼具气体动力学优点和液体溶解能力等方面的优势,有低成本、低毒性、产品易回收和洗脱液易循环使用的优点。在色谱中使用超临界CO2的限制主要是对目标产物的相对分子质量、极性与溶解性能的要求。超临界流体制备色谱和液相制备色谱可相互补充,用于有机杂质的制备。 2.定向合成方法制备杂质在获得杂质结构后,可根据杂质的结构采用定向合成方法制备杂质标准品。 3.杂质对照品的标定研究对制备出的杂质需进行鉴别定性和纯度测定。用元素分析、质谱、核磁共振谱、射线衍射等分析方法来阐明新化合物的结构。用色谱法、光谱法热分析法及联用技术等进行纯度测定。 |
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