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免疫组织化学（简称免疫组化）是组织化学的一种，它是利用已知的特异性抗体或抗原能特异性结合的特点，通过化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂，如酶、金属离子、同位素等，显示一定的颜色，并借助显微镜观察其颜色的变化，从而在抗原抗体结合部位确定组织、细胞结构的化学成份或化学性质。免疫组织化学（IHC）是许多实验室的主要免疫测定方法，用于证明重要蛋白质的存在与否，检测翻译后修饰，诊断疾病等等。IHC可以可视化细胞的独特细胞成分，广泛被病理学家和诊断人员使用。 
下面来看看具体的实验原理和操作步骤吧 1.固定：取新鲜组织，放入4%多聚甲醛 in PBS，用量为组织块体积的10-15倍，时间48h。（目的是除了使细胞内的蛋白质凝固，减少或终止内源性或外源性细胞内分解酶的反应，防止组织细胞自溶，更是为了保存组织或细胞内的抗原性，使抗原不失活，不发生弥散） 2.石蜡切片：取材→脱水（组织脱水的目的是使得组织内的水分逐步被替换出来，因为组织制成蜡块是要求组织要被熔化的石蜡所浸透，因为石蜡和水不相溶，脱水干净后才有助于下一步组织的浸蜡。脱水一般采用从低到高浓度乙醇脱水，组织经过70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇）→透明（组织透明的目的是把脱水剂乙醇用透明剂（二甲苯）置换出来，以利于熔化的石蜡进入组织，组织经脱水透明后，肉眼可见整块组织呈透明状，没有白色浑浊的状态，常用的透明剂是二甲苯）→浸蜡→包埋→切片→展片→捞片→60℃烤片1 h以上→4℃保存。 3.烤片：60°C烘箱烤片，至蜡透明溶解，可过夜。（这样做的目的是将组织牢牢的固定在载玻片上，并使石蜡融化） 4.脱腊：二甲苯I（60°C）20 min→二甲苯II（常温）10 min。（脱蜡复水，石蜡溶于二甲苯，可以去掉片子上的石蜡） 5.复水：乙醇（100%→100%→95%→85%→75%→50%）各3 min→纯水（抗原修复前一直在水中） 6.抗原修复：放至0.01 mol/L pH6.0柠檬酸盐缓冲液中，微波炉开到高火至开始沸腾，后调至中火保持95°C以上即可，煮沸20 min，自然冷却至室温。（抗原修复的目的在于暴露抗原抗体结合位点） 7.透化（膜蛋白无需）：0.3%TritonX-100 in PBS,室温孵育20 min，避光操作。（Triton X-100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合） 8.清洗：上下摇床，PBS，5 min。 9.封闭：甩干，画腊圈，滴加10%山羊血清 in PBST（50μL/片），湿暗盒中室温封闭1 h。（血清封闭的目的是去除非特异性的吸附，用正常的非免疫动物血清封闭组织中的能和抗体结合的位点，减少非特异性的背景，如二抗使用的是山羊抗兔的血清，则封闭血清选择正常的山羊血清。血清封闭后，不用PBS冲洗，直接弃去即可，直接滴加一抗） 10.一抗：将封闭液甩干，不清洗，合适浓度一抗加入10%山羊血清 in PBST（50μL/片），暗盒4°C过夜。 11.复温：37°C孵箱中孵育30-45 min（置于湿暗盒中，可适量补充抗体）。（一方面，防止切片从 4ºC 直接放入 PBS 易脱片。另一方面，使抗原抗体结合更稳定。一般不需要，但对表达较弱的抗原可能有用，4ºC 和 37ºC 时分子运动方式不同，前者分子碰撞机率和运动速度小于后者,后者结合更快，但敏感性也提高了并易造成非特异染色） 12.清洗：PBST清洗5min×3。 13.封闭内源性HRP：0.3%H2O2in甲醇,室温孵育15 min（AP检测，则可不需要封闭HRP）（组织中的一些细胞如红细胞、粒细胞等存在内源性过氧化物酶，这些酶与辣根过氧化酶类似也可以与显色剂DAB结合，进而造成假阳性，实验中可通过用3%的过氧化氢水溶液作用15分钟，消除内源性过氧化物酶操作可以在加一抗之前操作也可在加一抗之后操作。一般 3% 过氧化氢灭活时间短点，可以 10 min 左右；而 0.3% 过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般 10-30 min） 14.清洗：PBST洗5 min×3。 15.二抗
①抗体加入10%山羊血清 in PBST，室温1 h。 ②或用即用型试剂盒（Max Vision TM HRP-Polymer anti-Rabbit/Mouse IHC Kit）25°C，20 min 16.清洗：PBST洗5min×3。 17.DAB显色：PBS（850μL）+A+B+C（各一滴，约50μL），（卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法）避光1-10 min（不同抗体显色时间不同），放入蒸馏水中终止显色。（ABC法是利用卵白素与生物素之间具有高度亲和力这一生物学特性。先将生物素与辣根过氧化物酶（HRP）结合，形成生物素化的HRP，再与卵白素按一定比例混合，形成卵白素-生物素化的辣根过氧化物酶复合物，即ABC复合物。先用生物素化的第二抗体与特异性一抗结合，再与ABC复合物连接，形成抗原-特异性一抗-生物素化二抗-ABC复合物。最后用底物显色剂显色，以显示抗原所在部位。DAB 显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短抗体孵育时间。若很短时间就出现背景很深，还有可能是你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间） 18.染核：苏木素3 min（水洗去部分颜色）→1%HCl-酒精10-30 s→1%氨水返蓝1 min→纯水洗净 19.脱水：梯度酒精（50%→75%→85%→95%→100%→100%）各2 min→二甲苯I，3 min→二甲苯II，5 min。（二甲苯将组织中酒精置换出来，二甲苯5min使切片透明化） 20.封片：中性树胶
（1）0.01 mol/L pH6.0柠檬酸盐缓冲液（810 ml A+190 ml B） A.二水合柠檬酸三钠：2.941g/L，0.01 M，pH 8.0（或直接取2.382g/810ml） B.柠檬酸：2.1014g/L，0.01M，pH 2.0 （2）1%氨水：1 ml浓氨水+99 ml PBS （3）1% HCl-酒精：1 ml 浓盐酸+99 ml 75%乙醇 4%多聚甲醛对组织穿透性好，组织收缩性小，对大多数抗原物质保存较好，特别是对脂肪和酶，适用于免疫组化。固定时间以24h为宜，不足可能导致边缘染色，固定过度可能会掩盖表位。 大部分福尔马林固定的组织在免疫组化染色前需要进行抗原修复步骤。固定过程中形成的亚甲基桥会将蛋白交联起来，掩盖掉抗原位点。抗原修复方法则会破坏这些亚甲基桥，暴露出抗原位点，使抗体能够与之结合。用于抗原修复的两种方法分别为热诱导表位修复法和酶修复法。酶修复有时会破坏切片形态，因此需要对浓度和处理时间进行测试。 （1）热修复 ①柠檬酸盐缓冲液 ②1 mM EDTA，pH 8.0 EDTA 0.37 g 蒸馏水 1 L 用 NaOH 将 pH 调节至 8.0 室温下可储存 3 个月 （2）酶修复法 ① 链酶蛋白酶（实验室自制） CaCL2 0.1g 链酶蛋白酶(蛋白酶K替代) 0.1g 蒸馏水 100 ml NaOH 0.1M 将CaCL2溶解在蒸馏水中，再将蛋白酶K溶于CaCL2溶液中，NaOH调PH至7.8 ② 胰蛋白酶 胰蛋白酶母液（0.5% 蒸馏水溶液） 胰蛋白酶 50 mg 蒸馏水 10 mL 混合溶解，储存于 -20 ℃ 氯化钙母液 (1%) 氯化钙 0.1 g 蒸馏水 10 mL 充分混合并储存在 4 ℃ 条件下 胰蛋白酶工作液 (0.05%) 胰蛋白酶母液 (0.5%) 1 mL 1% 氯化钙母液 1 mL 蒸馏水 8 mL 用 1M NaOH 调节 pH 至 7.8。可在 4 ℃ 条件下储存一个月或在 -20 ℃ 下长期储存 一抗和二抗的稀释倍数参考抗体说明书，不同组织需通过预实验进行梯度稀释来确定最适宜的稀释倍数。 二抗可能会与组织中的内源性免疫球蛋白发生交叉反应，使用产生二抗宿主来源的非免疫血清预处理该组织可最大程度减弱此反应。在一抗孵育之前使用非免疫血清进行封闭可避免 Fc 受体与一抗和二抗的结合。 H2O2 处理可能会修饰某些抗原表位，影响这些抗原与抗体的结合。在一抗孵育步骤后，再使用H2O2 孵育组织可避免这一问题，H2O2可使用PBS或水进行稀释。 对于血液涂片或其它富含过氧化物酶的组织建议使用甲醇溶液；用甲醇稀释过氧化物还有助于减少水溶液引起的对组织的损伤。其它组织使用 PBS 或水进行稀释，甲醇/H2O2溶液孵育会导致某些抗体-抗原的结合有所下降，其中细胞表面蛋白质尤为明显。如果使用AP（碱性磷酸酶） 或荧光检测，则可不需要封闭过氧化氢酶，封闭过氧化氢酶仅适用于 HRP 偶联物。 含0.3% TritonX-100的PBS溶液可破坏组织的细胞膜，增加细胞通透性，允许抗体达到细胞内的目标，也可降低表面张力，使试剂轻松覆盖整个组织切片。该溶液还可溶解 Fc 受体并减少非特异性结合。 一抗宿主应与所检测的组织来源不同，如果使用小鼠组织，并且一抗也是来源于小鼠，则抗小鼠 IgG 二抗会与小鼠组织中的所有内源性 IgG 结合，并导致背景偏高。 组织在实验过程中应保持湿润，腊圈画的不宜过小。 若脱水后切片上有大量油珠，则将玻片架从二甲苯中拿出，于通风橱中风干，再放入二甲苯中，进行封片。 分享到这啦 祝大家实验顺利
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