微血管内皮细胞
微血管内皮细胞 准备好ECGM内皮细胞培养基(为了防止污染,可使用三抗进行初代培养)(启达生物:P1001)、细胞包被液(启达生物:SD0044 )含有2.5%FCS加三抗的PBS,磁珠抗体,细胞筛,胰蛋白酶,眼科剪,等等 ECGM内皮细胞培养基(启达货号:P1001) 细胞包被液(启达货号:SD0044) 1.使用过量的异氟烷对老鼠实施安乐死。最好在一分钟内导致老鼠呼吸停止,时间太长会产生缺血灌注反应,导致提取的细胞内血液细胞太多,正常内皮无法获取营养繁殖。 2.使用高压灭菌仪器尽可能无菌地去除小鼠的心脏、肺和肝脏等器官,并在加入2X双抗的PBS中冲洗以去除血液。 3.在培养皿中,使用无菌交叉手术刀,将需要提取的组织解剖成2mm³块。 4.通过低速离心(210 x g,1分钟)在PBS中洗涤两次。 5.在37°C的潮湿培养箱中,将切片组织在胶原酶2溶液(0.5 mg/ml)中培养1小时。 注:我们使用Gibco®II型胶原酶,因为与其他胶原酶制剂相比,它具有更高的梭菌蛋白酶活性,非常适合消化心脏、骨骼、甲状腺、软骨和肝脏组织。 6.随后,每10 ml细胞悬浮液添加75µl DNase I溶液,并在37°C水浴中连续搅拌再孵育30分钟。 7.将消化后的组织通过细胞过滤器,以去除未消化的块。 8.用补充有2.5%FCS并且加双抗的PBS冲洗细胞滤网两次,以收集任何剩余的细胞。 9.在0.25%胰蛋白酶(每100mg组织用1ml胰蛋白酶)中再孵育10分钟,获得单细胞悬浮液。 10.在补充有2.5%FCS的500µl PBS中洗涤一次。 11.用鼠免疫球蛋白在4°C下孵育30分钟以阻断Fc受体。 注:小鼠BD-Fc块是纯化的大鼠IgG2b抗小鼠CD16/CD32单克隆抗体。 12.在补充有2.5%FCS的冷PBS中洗涤两次。 13.与大鼠抗小鼠CD31、大鼠抗鼠CD105和生物素化的隔离蛋白B4在4°C下孵育45分钟。 14.在补充有0.5%FCS的冷500µl PBS中洗涤两次,并计数细胞。 15.重新悬浮颗粒,并与PBS 0.5%FCS(200μl/l,2.5 x 107细胞)、大鼠抗小鼠Ig(25μl/l、2.5 x 107个细胞)和链霉亲和素结合的微珠(25μl/l,2.5×107细胞)在4°C下孵育15分钟(总体积250μl)。同时,将色谱柱加载到分离装置上(每1-2.5 x 107个细胞使用一个色谱柱),并按照制造商的说明用500μl PBS 0.5%FCS清洗每个色谱柱。 16.将250μl细胞悬浮液装入每个柱中。磁性标记的细胞保留在柱中,而未标记的细胞通过。细胞悬浮液流过柱后,用500μl PBS 0.5%FCS洗涤柱两次。不同品牌的仪器请参阅仪器制造商网站上的视频或者说明书。 17.将柱从磁铁上卸下,并使用提供的柱塞用PBS 0.5%FCS洗脱磁性保留的细胞。 18.洗涤洗脱的细胞,以200 x g离心5分钟。(在第一铺板的时候,ECGM培养基的血清浓度可提高到10%左右),(10^5cell/ml)中再悬浮,并在用包被液预涂的培养皿或者培养瓶(中培养。因ECGM培养基配方采用小分子化合物抑制杂细胞生长,采用蛋白诱导内皮细胞生长,可以让得到的内皮细胞传代更多并且纯度也更高,培养15天发现在任何阶段都没有观察到非内皮来源的污染细胞的过度生长。此方法提取和培养微血管内皮纯度在95%以上。 温馨提示 集文献领红包活动开始啦~ 使用我们的产品发表在各大期刊上的文章备注:Shanghai QiDa Biotechnology Co.,LTD文字的,领取现金红包。 或参加公司年度助学计划,最高分可得奖励现金3000元。每年评选2人!有文献的老师请加微信客服:17521589219 领取哦,每篇文章限参加一次! |
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