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自1942年首次发现以来，免疫荧光染色一直是一种高度可靠和强大的技术，用于广泛的研究和诊断目的。
用荧光分子标记的白血病细胞 通常，荧光抗体（FA）技术将涉及使用细胞或抗体，其恒定区域已用荧光标记标记（也称为荧光团）标记。FA技术通常分为直接或间接。 直接荧光抗体 直接荧光抗体技术，也可以称为直接免疫荧光（DIF），涉及使用单个荧光标记的一抗，用于与靶抗原结合。当临床使用时，DIF对于快速诊断细菌性疾病特别有用，如化脓性链球菌（通常称为链球菌）以及肺炎支原体和嗜肺军团菌属引起的肺炎。 出于这种诊断目的，首先将患者样本放在显微镜载玻片上，然后暴露于荧光抗体中。荧光标记抗体和靶抗原（在这些情况下是细菌）之间的任何结合都会导致这些物质在用荧光显微镜检查时发光。 除了用作诊断工具外，DIF还广泛用于科学研究。为此，将切成5或6微米（μm）薄片的冷冻组织样品放置在载玻片上。 然后将载玻片与荧光标记抗体一起孵育，荧光标记抗体通常包括一组针对IgA，IgG和IgM抗体同种型的抗体以及针对目标抗原的补体3。 请注意，用于此类研究的抗体浓度将基于先前的实验，这些实验已确认哪种浓度可以达到最高的信噪比。 在载玻片在黑暗和室温下孵育至少30分钟后，洗涤载玻片，然后用荧光显微镜成像。
间接荧光抗体 与用于DIF的单步技术相比，间接IF（IIF）或间接FA（IFA）是一个两步过程，首先将未标记的一抗施加到针对靶抗原的样品上。IIF的第二步涉及使用荧光标记的二抗，该二抗针对一抗的Fc部分。 尽管IIF被认为比DIF更复杂，因为它需要更长的时间才能完成并且需要使用两种兼容的抗体，但它在灵敏度方面更胜一筹。 IFA测试的一些常见临床应用包括用于诊断梅毒的测试。对于这种类型的IFA测试，先前从研究动物中分离出的T. Palladium细胞被分离并放置在载玻片的表面上。然后将从患者获得的血清散布在钯锥虫细胞上，以允许抗密螺旋体抗体（如果存在）与固定抗原结合。 冲洗掉患者的血清样本后，加入用荧光团标记的二抗。梅毒阳性结果将照亮所有二抗-荧光团偶联物复合物。 另一种广泛用于临床环境的IFA是用于诊断系统性红斑狼疮（SLE）的IFA。SLE是一种自身免疫性疾病，其循环抗核自身抗体（ANA）水平将增加，这些抗体针对DNA和与DNA结合的各种蛋白质。 对于这种类型的IFA测试，将细胞培养，然后放置在载玻片上。然后将每张载玻片与不同浓度的患者抗体一起孵育，然后洗涤以去除任何未结合的蛋白质。在洗涤步骤之后，将荧光标记的二抗（用于ANA测试）添加到载玻片中并使其孵育。然后从显示荧光的最高血清稀释度中获得血清中 ANA 的滴度，并用于确定 SLE 诊断。 流式细胞术 第三种类型的荧光抗体技术包括流式细胞术，这是一种自动细胞计数系统，可用于定量存在于复杂混合物（如血液或血清）中的特定细胞。 典型的流式细胞术实验将从孵育荧光标记的抗体开始，该抗体针对特定的细胞亚群，例如抗CD4，其可以与各种免疫细胞表面发现的糖蛋白CD4结合，包括T辅助细胞，单核细胞和巨噬细胞。流式细胞术还可以通过使用适当的细胞制造商来量化多种细胞类型的存在。 孵育完成后，将样品引入流式细胞仪。在这台机器中，狭窄的毛细管迫使样品中存在的细胞在单个文件中移动。当细胞穿过毛细管时，激光用于激活和激发任何已用荧光团标记的细胞。 然后通过正向和侧向散射检测器测量每个激发细胞的荧光强度，并将其描绘在直方图上进行分析。除了定量目的外，流式细胞术和免疫荧光都可用于通过称为荧光激活细胞分选仪（FACS）的技术将细胞分选为纯化的亚群以进行研究。 参考文献 [1]Odell, I. D., & Cook, D. (2013). Immunofluorescence Techniques. Journal of Investigative Dermatology 133. DOI:10.1038/jid.2012.455. [2]Parker, N., Schneegurt, M., Tu, A. T., et al. (2016). Chapter 20.5 Fluorescent Antibody Techniques. In: Microbiology. [3]Betterle, C., & Zanchetta, R. (2012). The immunofluorescence techniques in the diagnosis of endocrine autoimmune diseases. Autoimmunity Highlights 3(2); 67-78. DOI:10.1007/s13317-012-0034-3. |
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