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线粒体是细胞的动力源，因为它们以三磷酸腺苷（ATP）的形式产生了大部分的能量供应。线粒体是一种双膜细胞器：一种外膜和一种折叠的内膜，称为嵴。分离的线粒体是研究线粒体呼吸、呼吸复合体组装、细胞凋亡、mtDNA和mtRNA以及线粒体蛋白分析的首选样本。 Biogradetech线粒体提取试剂盒为分离完整的线粒体提供了两种选择。第一种选择是利用一种基于试剂的方法，允许平行处理多个样品。第二种选择使用传统的跳跃均质化，这提供了更好的线粒体产量。 微光应用程序： 从组织和培养细胞中分离出高纯度、完整和有功能的线粒体。 线粒体呼吸研究，复合物的组装，细胞凋亡，mtDNA和mtRNA，以及蛋白质谱分析。 西方印迹和ELISA。 线粒体提取样品类型： 哺乳动物组织。 培养细胞。 储存和处理： 存储工具包在-20°C，避光。在使用前解冻试剂。在进行实验前，请读取整个方案。 线粒体提取试剂盒（D-AKE4003-50T）分离方案： 1.样品制备： a. 培养细胞：小颗粒2 x107细胞在600 xg下离心10 min。小心地去除并丢弃上清液。 b. 组织：分离出感兴趣的组织。将组织（50-200 mg）浸泡在1毫升冰冷的线粒体分离缓冲液中，并冲洗两次以除去血液。用1毫升冰冷的线粒体分离缓冲液，用剪刀将放在冰上的组织切成小块。将切碎的组织在桌面离心机中以10000xg旋转2 min。弃用缓冲液，换上1 ml新鲜冰冷的线粒体分离缓冲液。 2.线粒体分离的程序： a.使用Dounce均质器分离线粒体：在线粒体分离缓冲液中使用预冷玻璃均质器对组织或细胞进行均质化。在冰上敲击样品3-4次。组织或细胞与线粒体分离缓冲液之间的最佳比例范围为1：5-1：10（w/v）。将匀浆转移到试管中，以600 x g离心10 min。在4°C。将上清液收集于单管中，7000xg离心10 min。在4°C。弃出上清液，再次用线粒体分离缓冲液清洗颗粒。取出上清液，在存储缓冲液中重悬线粒体。确定蛋白质浓度，并使用存储缓冲液调整到所需的蛋白质浓度。 b.基于试剂分离线粒体方法：在细胞颗粒中加入1 ml线粒体分离缓冲液，涡旋5秒，冰孵育2 min。加入10µl试剂A，涡旋5秒。冰敷5 min。同时每分钟旋转一次。持续5秒。600 x g离心机，离心机为10 min。在4°C。将上清液收集于单管中，7000xg离心10 min。在4°C。弃出上清液，用线粒体分离缓冲液清洗颗粒。取出上清液，在存储缓冲液中重悬线粒体。确定蛋白质浓度，并使用存储缓冲液调整到所需的蛋白质浓度。 记下 a.为了避免蛋白质降解，建议您在线粒体分离缓冲液中加入蛋白酶抑制剂鸡尾酒。 b.均质化的中风次数将取决于细胞或组织类型的不同。 c.对于细胞，为了检查细胞裂解效率，将5µl的细胞裂解液涂成载玻片，加入盖层，在显微镜下观察。对于组织，进行足够的中风以获得均匀的悬浮液而不溶解细胞。通常对于软组织，10,15次中风和对于硬组织，5-10次中风就足够了。 3.基于应用程序的存储条件：对于完整的线粒体，在存储缓冲液中重悬。保持冰立即使用或在液氮中快速冷冻，储存在-80°C以备将来使用。为了装载凝胶的目的，线粒体可以存储在适当的样品PAGE缓冲液中（未提供）。
图：线粒体完整性检测：按照上述方案，从小鼠肝脏中纯化出线粒体（100µg）。用JC-1染料检测纯化后的线粒体的完整性，该染料检测线粒体内膜的电化学化质子梯度（ΔΨ）。将纯化后的线粒体放在冰上解冻，并与JC-1染料（1µg/ml）孵育15 min。在37°C。完整的纯化线粒体显示JC-1染料的聚集，其信号可以在Ex/Em = 530/590 nm处测量。用抗霉素A（100µM）处理可消散线粒体膜电位，导致荧光信号降低。 *仅供研究使用！不能用在人类身上 |
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