蛋白提取系列最后一节：核蛋白提取

yjt2004us 2019-02-19

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不知不觉年算是过完了，这次离开家不知下次归期又是何时，每每羡慕本地人家，可以随时随地回家，可以不用太长时间的奔波，可以在父母身边。回家，一说起来就让人很开心，虽然回家这星期特别忙碌，但是心情却是无比放松，挨家挨户的串亲戚，哥哥，婶婶，姐姐，姐夫，东奔西跑的认长辈，舅舅，舅妈，大爷，大娘，觥筹交错的瞎聊天，来来往往，热热闹闹，甚是开心。

一年不见，小侄子竟会跑了，去年见还是抱在怀里，不顺心就哇哇地哭，小侄女要上一年级了，还会背英语了，大侄女都要上初中了，好像会打扮自己了。。。现在小孩子都坐满一桌了，正如我们小时候，四五个哥哥姐姐在前面跑着玩，五六岁的我在后面开心的跟着，刚会跑的妹妹在后面喊着，姐，等等我，啪唧，又摔了一跤。。。

正如我们小时候，一大院子的人打牌，2定主，升级，拱猪，争上游，你应该先出3，xx拿错牌了，还是xx打的好。。。正如我们小时候，初中以后学习压力还是来了。。。正如我们小时候，那时候所有的家人都还在。仿佛看到了当时的父母，是不是也像我们现在一样年轻，是不是也在努力拼搏，为我们撑起一片天，是不是也曾想过多陪陪自己的父母。以后的自己不知道能不能做到像父母一样那么优秀，但是一定会多回家陪陪父母，父母在，人生尚有来处。。。

提蛋白的系列到现在就差不多结束了

核蛋白的提取也如之前一样，自己配制和试剂盒提取都有提及。

A液：5mM PIPES pH 8.0， 85mM KCL， 0.5%NP40，1%cocktail
B液：50mM Tris-Cl pH 8.1， 10mM EDTA，1% SDS，1% cocktail

细胞样品

1.如提取总蛋白一样，弃去培养基，在培养皿中加入1ml冷的PBS，洗三次，再加入PBS。
2.用细胞刮尽可能刮下细胞，收集到1.5mlEP管中。预冷离心机，4℃，1,000g，离心4分钟（为尽可能多的获得细胞，可将离心后的上清再重复刮细胞一次）。
3.弃掉上清，将细胞重悬于A液中（加入的体积按10^6/200ul，10cm dish加1ml）。接4-7。

组织样品

1.称重20-100mg组织样品，放入预冷的1.5ml 离心管中。
2.用预冷的PBS清洗组织样品。500g离心5分钟，弃去上清，使沉淀干燥。
3.加入适量A液。
4.冰上放置1h（不震荡，可偶尔用枪轻吹，此时核膜没有破），充分裂解。
5.４℃，1000g，20分钟，上清为胞质蛋白（蛋白浓度比较低，如需要检测，建议先浓缩一下），沉淀为细胞核。
6.将沉淀重悬于100-200ul B液中，冰上放置30分钟至1小时（每5分钟震荡一次），充分裂解；可以观察到沉淀慢慢消失，溶液变澄清。
7.4℃，12,000g离心20分钟，上清即为细胞核蛋白。

试剂盒提取1:PIERCE公司NE-PERTM核及胞浆蛋白抽提试剂盒（78835）

核蛋白提取步骤

细胞样品

1.弃去培养基，在培养皿中加入1ml冷的PBS，洗三次，再加入PBS。
2.用细胞刮尽可能刮下细胞，收集到1.5mlEP管中。预冷离心机，4℃，1,000g，离心4分钟。

用枪头小心吸弃上清液（注意尽量吸干），细胞沉淀中按表格1加入冰冷CERⅠ溶液，接转胞质胞核分离步骤；
表格1，不同细胞量应加入相应体积缓冲液

组织样品

称重20-100mg组织样品，放入预冷的1.5ml 离心管中。
用预冷的PBS清洗组织样品。500g离心5分钟，弃去上清，使沉淀干燥。
按表格2加入适量胞浆提取缓冲液，电动匀浆器匀浆，去除没有完全匀浆的组织碎片。接转胞质胞核分离步骤。
表格2，不同组织样品量应加入相应体积缓冲液
不同组织样品量应加入相应体积缓冲液

胞质胞核分离步骤：

1.旋涡剧烈震荡15秒（重悬细胞沉淀），冰上孵育10分钟；
2.再加冰冷CERⅡ溶液；
3.旋涡剧烈震荡5秒钟，冰上孵育1分钟；
4.旋涡剧烈震荡5秒钟，然后在16,000g（最大速度）离心5分钟；
5.立即将上清液（胞浆蛋白）移入一预冷EP 管中（冰上）；
6.再次旋涡震荡悬浮未溶解部分，然后，加入冰冷的NER溶液；
7.旋涡剧烈震荡15秒×4，其间冰上静置10分钟；
8.16,000g离心10分钟；
9.立即将上清液（核提取物）移入一预冷EP 管中（冰上）；-80℃保存。

试剂盒提取2：Invent 胞质胞核分离试剂盒（Sc-003）

操作方法：

细胞样品

1.贴壁细胞生长至融合度90-100%，将预冷的PBS直接加入细胞培养板，培养皿或培养瓶中清洗细胞两次，吸去上清。
2.按表格1将适量的胞浆提取缓冲液均匀的加入整个器皿表面，冰上静置5分钟。用吸头吹打几次后转移到预冷的1.5ml离心管中。涡旋大力震荡15秒。接转胞质胞核分离步骤。
表格1，不同细胞量应加入相应体积缓冲液
不同细胞量应加入相应体积缓冲液

组织样品

1.称重适量组织样品，放入预冷的1.5ml 离心管中。
2.用预冷的PBS清洗组织样品。3000rpm离心1分钟，弃去上清，使沉淀干燥。
3.按表格2加入适量胞浆提取缓冲液，电动匀浆器匀浆，去除没有完全匀浆的组织碎片。接转胞质胞核分离步骤。
表格2，不同组织样品量应加入相应体积缓冲液
不同组织样品量应加入相应体积缓冲液

胞质胞核分离步骤

1.4℃，最高速离心5分钟。
2.将上清液（上清为胞浆组份）转移到一个新的预冷的1.5ml离心管中。将沉淀（可选优化：用0.5ml预冷PBS重悬，10,000rpm，离心5分钟清洗沉淀可以减少胞浆蛋白污染）中加入适量的胞核提取缓冲液，涡旋大力震荡15秒，冰上孵育1分钟。然后重复震荡15秒，冰上孵育1分钟四次。（如核蛋白提取浓度低，可适当延长每次孵育及震荡时间）
3.迅速将核提取物转入到预冷的离心管套管中，14,000rpm，离心30秒。弃掉离心管柱。将核蛋白储存于-80℃。一般产量1.5-2.5mg/ml。

核内参推荐使用Lamin-B1，检测核内参请勿使用H3，已有文献证实，线粒体中也含有H3，本试剂盒分离后，线粒体存在于胞浆组分，如用H3检测胞浆，一定会检出胞浆中有H3。

为什么会用两种提核蛋白的试剂，是因为发现用两种方法提取的核蛋白都可以做Western blot，但是在做EMSA时，就发现后者的条带比较淡，即使加量多一倍，仍然不如前者好，但是后者提取时间缩短很多。

之前总觉得需要什么就提取什么，其他的都没有太在意就浪费了，不过最近看了一篇，原来还可以这样操作。
准备试剂：

A液：50 mM Hepes, 150 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 调整 pH至7.5
B液：100 mM phosphate buffer, 150 mM NaCl, pH 8, 1.5% TritonX-100, 10% glycerol

操作步骤：

1.弃去培养基用PBS洗2次后，加入冷的A液。
2.在裂解液中用细胞刮子收集所有细胞，转移裂解液至EP管，用21号针头反复吹打裂解细胞。
3.1000g离心3min，将上清转移至另一EP管(A管)，沉淀用适量含1%SDS A液溶解即可得到核蛋白。
4.将A管上清21460g，4 °C离心1h，即可得到胞浆蛋白（上清）和胞膜/骨架蛋白（沉淀）。
对于沉淀根据需要有两种处理，

A. 将沉淀用含SDS的裂解液溶解，即可得到溶于SDS的胞膜/骨架蛋白。
B. 将沉淀用含TritonX-100裂解液B液溶解，即可得到溶于Triton X-100（Sol）的胞膜/骨架蛋白，转移上清后剩下沉淀使用含SDS裂解液溶解，即可得到不溶于Triton X-100（Insol）的胞膜/骨架蛋白。

终于，提蛋白暂时结束了，我也只是写了自己常用的，以后接触到新的提蛋白的组分和方式再来补充，下周二不见不散🙂。

以下是豆子老师的蛋白提取帖子：