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作为中心法则的初始一环，DNA复制是最基本最重要的细胞生物过程之一。地球上所有物种的性状遗传都依赖于其全部染色体准确及完整的复制。DNA复制紊乱所产生的缺陷会导致细胞基因组不稳定性，威胁生物个体的生长、发育甚至正常存活 (O’Donnell et al., 2013) 。关于真核生物的DNA复制分子机制的研究不仅有助于理解这个最重要的生物过程，而且能为复制缺陷导致的衰老以及癌症等疾病的分子病理研究提供理论指导，及其诊断和治疗提供新方案。目前关于真核生物DNA复制的基本认识主要来源于对酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 等简单真核模式生物的研究。目前已经可以在体外完全利用重组蛋白重建酿酒酵母DNA复制的主要过程 (Yeeles et al., 2015; Yeeles et al., 2017; Deegan et al., 2019)，故酿酒酵母DNA复制过程的主线已相对清晰。完成复制过程的超级复合物被称为复制体（replisome）或者复制机器（replication machinery）。真核生物复制体的核心是复制解旋酶（replicative helicase）CMG复合物（Cdc45-Mcm2-7-GINS），CMG解旋酶是由六亚基MCM2-7 ATP水解酶（ATPase），CDC45蛋白以及四亚基复合物GINS所组成的十一亚基超复合物。故真核生物的DNA复制起始过程的本质在于CMG解旋酶的装配和激活。酿酒酵母的复制起始过程为依赖于两种激酶：DDK（Dbf4-dependent kinase）与S期CDK（Cyclin-dependent kinase），可以分为四个步骤：1. Mcm2-7双六聚体的装配，这个过程也被称为复制起点许可（origin licensing）(Remus et al., 2009) ；2. Cdc45招募，这个过程依赖Sld3-Sld7蛋白复合物 (Deegan et al., 2016)；3. GINS招募以及CMG装配，这个过程依赖Dpb11、Sld2以及聚合酶Pole (Zegerman and Diffley, 2007)；4. CMG的激活，组装后的CMG解旋酶没有解旋的能力，需要在Mcm10蛋白进一步激活下才成熟成激活态解旋酶，打开双链DNA，为引发酶以及聚合酶提供模板(Quan et al., 2015; Douglas et al., 2018)。上述步骤完成之后，DNA复制过程进入复制行进阶段。 
表1. DNA复制起始因子在不同真核生物间的同源蛋白相对清晰的酿酒酵母DNA复制过程为其它高等真核生物，尤其是后生动物的DNA复制研究提供了一个基本框架。如表1所示，所有参与复制起始过程的酿酒酵母蛋白都能在后生动物物种中找到对应同源蛋白。故之前的研究普遍认为，后生动物的DNA复制起始过程与酿酒酵母类似。2023年8月17日，英国邓迪大学英国医学研究委员会蛋白磷酸化与泛素化中心（MRC PPU）Karim Labib研究组与山东大学生命科学学院洪烨课题组、英国医学研究委员会分子生物实验室（MRC LMB）Joseph Yeeles研究组、以及英国邓迪大学的Constance Alabert研究组合作在Science上以长文形式在线发表了题为 DNSN-1 recruits GINS for CMG helicase assembly during DNA replication initiation in C. elegans 的文章，揭示了DONSON同源蛋白参与DNA复制起始过程的机制。该研究利用模式动物秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans），鉴定出一个新的CMG结合蛋白：DNSN-1（线虫中的DONSON同源蛋白）。根据目前研究，人源DONSON被鉴定为小头原始侏儒症（Microcephalic Primordial Dwarfism, MPD）的易感基因，但其具体致病机制不明 (Reynolds et al., 2017)。该研究发现DNSN-1为维持线虫生长发育的必需基因，DNSN-1敲除的线虫发育阻滞，并无法生育。敲低DNSN-1会严重抑制线虫胚胎细胞的DNA复制水平。进一步研究发现，DNA复制起始过程依赖DNSN-1，而复制行进过程不依赖DNSN-1。这个发现具有颠覆性，因为以酿酒酵母为代表的真菌物种不存在DONSON的同源蛋白（如表1所示），换言之酿酒酵母的复制起始过程也不需要与DONSON功能类似的蛋白参与。随后该研究初步探明了DNSN-1参与DNA复制起始的具体步骤，发现DNSN-1负责起始过程中GINS的招募，从而调控CMG解旋酶的组装。如下图所示。图：DNSN-1参与DNA复制起始过程中的GINS招募过程。与之相呼应的是Science同期也发表了美国哈佛医学院的Johannes Walter研究组和英国医学研究委员会人类遗传中心（MRC HGU）的Andrew Jackson研究组题为In silico protein interaction screening uncovers DONSON’s role in replication initiation 的文章（详见今日BioArt解读）；以及，日本东京药科大学的桥本吉民研究组在EMBO J.杂志发文 Novel role of DONSON in CMG helicase assembly during vertebrate DNA replication initiation。上述两个研究同时在体外非洲爪蟾复制系统中发现DONSON同源蛋白参与复制起始过程，并发挥如同线虫DNSN-1一致的功能。上述研究均表明，DONSON介导的DNA复制起始阶段的CMG组装在后生动物间具有高度的保守性，而后生动物DNA复制起始的分子机制与单细胞酿酒酵母存在重大差异。故以上述研究为起点，后生动物DNA复制起始的分子机制急需进一步探究。并且，以线虫和爪蟾为模式动物的研究可以弥补酿酒酵母在小头畸形侏儒症等复制缺陷相关疾病研究中的不足，为相关疾病的诊断和治疗奠定基础。深圳大学基础医学院的夏乙燧、英国MRC PPU的Remi Sonneville以及英国MRC LMB的Michael Jenkyn-Bedford为共同第一作者。洪烨教授，Joseph Yeeles教授和Karim Labib教授为该论文的共同通讯作者。注：论文第一作者夏乙燧博士已全职加入深圳大学基础医学院，主要开展后生动物DNA复制分子机理的研究与复制缺陷相关罕见病及肿瘤分子病理的研究，招聘生物化学等方向博士后2-3名，科研助理1-2名，待遇从优，有兴趣的请将简历投递。原文链接： 1. http:///10.1126/science.adi4932 2. http:///10.1126/science.adi3448 3. https://www./doi/epdf/10.15252/embj.2023114131 参考文献 1.Hashimoto Y., Sadano K., Miyata N., Ito H., Tanaka H. (2023). Novel role of DONSON in CMG helicase assembly during vertebrate DNA replication initiation. EMBO J. Jul 17:e114131. 2.O'Donnell, M., Langston, L., and Stillman, B. (2013). Principles and concepts of DNA replication in bacteria, archaea, and eukarya. Cold Spring Harb Perspect Biol 5. 3.Yeeles, J.T., Deegan, T.D., Janska, A., Early, A., and Diffley, J.F. (2015). Regulated eukaryotic DNA replication origin firing with purified proteins. Nature 519, 431-435. 4.Yeeles, J.T.P., Janska, A., Early, A., and Diffley, J.F.X. (2017). How the Eukaryotic Replisome Achieves Rapid and Efficient DNA Replication. Mol Cell 65, 105-116. 5.Deegan, T.D., Baxter, J., Ortiz Bazan, M.A., Yeeles, J.T.P., and Labib, K.P.M. (2019). Pif1-Family Helicases Support Fork Convergence during DNA Replication Termination in Eukaryotes. Mol Cell 74, 231-244 e239. 6.Remus, D., Beuron, F., Tolun, G., Griffith, J.D., Morris, E.P., and Diffley, J.F. (2009). Concerted loading of Mcm2-7 double hexamers around DNA during DNA replication origin licensing. Cell 139, 719-730. 7.Deegan, T.D., Yeeles, J.T., and Diffley, J.F. (2016). Phosphopeptide binding by Sld3 links Dbf4-dependent kinase to MCM replicative helicase activation. EMBO J 35, 961-973. 8.Zegerman, P., and Diffley, J.F. (2007). Phosphorylation of Sld2 and Sld3 by cyclin-dependent kinases promotes DNA replication in budding yeast. Nature 445, 281-285. 9.Quan, Y., Xia, Y., Liu, L., Cui, J., Li, Z., Cao, Q., Chen, X.S., Campbell, J.L., and Lou, H. (2015). Cell-Cycle-Regulated Interaction between Mcm10 and Double Hexameric Mcm2-7 Is Required for Helicase Splitting and Activation during S Phase. Cell Rep 13, 2576-2586. 10.Douglas, M.E., Ali, F.A., Costa, A., and Diffley, J.F.X. (2018). The mechanism of eukaryotic CMG helicase activation. Nature 555, 265-268. 11.Reynolds, J.J., Bicknell, L.S., Carroll, P., Higgs, M.R., Shaheen, R., Murray, J.E., Papadopoulos, D.K., Leitch, A., Murina, O., Tarnauskaite, Z., et al. (2017). Mutations in DONSON disrupt replication fork stability and cause microcephalic dwarfism. Nat Genet 49, 537-549.
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