 导语 今天给同学们分享一篇单细胞+机器学习+预后模型的生信文章“System analysis based on the T cell exhaustion‑related genes identifies CD38 as a novel therapy target for ovarian cancer”，这篇文章于2023年6月27日发表在Oncol Res期刊上，影响因子为3.1。  卵巢癌（OV）是女性中最致命和最具侵略性的癌症之一，近年来发病率有所增加。由于卵巢癌早期症状隐匿且癌症发展迅速，大多数患者直到疾病晚期才被诊断出来。此外，卵巢肿瘤的异质性限制了现有预后标志物的预测准确性，也加剧了患者的预后。目前，手术和化疗放疗是卵巢癌最常见的治疗策略。 1. 细胞聚类分析OV 研究设计在图1的流程图中概述。从5名卵巢癌患者获得的单细胞RNA测序数据进行筛选，并根据空间分布（图2A，左侧）以及特征标记对细胞进行注释。注释了六种细胞类型，包括成纤维细胞、T细胞、髓系细胞、上皮细胞、内皮细胞和B细胞（图2A，右侧）。图2B显示了八个经典标记基因的表达谱，图2C中的气泡图显示了它们在每种细胞类型中的表达情况。根据绝对计数，T细胞亚群在几乎所有样本中占主导地位，这表明这些细胞在卵巢癌进展中起着关键作用（图2D）。此外，每个细胞亚群中其他细胞类型的含量差异显著，这证实了卵巢癌的细胞异质性。  图1 流程图显示研究设计  图2 OV的单细胞聚类分析 2. T细胞亚群的维度聚类分析 在对T细胞亚群进行降维聚类分析后，作者注释了四个亚群，包括CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、调节性T细胞（Tregs）和CD8+ 耗竭T细胞（图3A）。每个细胞亚群中特征基因的表达情况显示在图3B的气泡图中。CD8+ T细胞是样本中最丰富的亚群（图3C），而CD8+ 耗竭T细胞在每个样本中最为稀少。对T细胞亚群中差异表达基因的分析表明，CXCL13和HAVCR2在CD8+ 耗竭T细胞中显著上调（图3D）。  图3 T细胞亚群的维度聚类分析 3. 通路分析 肿瘤相关通路的GSEA分析进一步探索了T细胞亚群在生物功能上的差异。在CD8+ T细胞中，肌肉生成和上皮间质转化通路显著激活，而CD4+ T细胞中的TNFA信号通过NFKB通路激活。Tregs与氧化磷酸化、胰岛β细胞和过氧化物酶通路显著相关，而CD8+疲惫T细胞则在干扰素α响应、干扰素γ响应、MYC靶基因V1、氧化磷酸化、E2F靶基因和G2M检查点通路中显著富集（图4A和图4B）。随后，作者根据PROGENy评分分析了不同细胞群体中的肿瘤相关通路。如图4C所示，JAK-STAT和MAPK通路被激活，而p53和PI3K通路在CD8+疲劳T细胞中被抑制。CD8+疲劳T细胞与其他T细胞亚群之间的受体配体对分析显示HLA−A−CD8A、HLA−B−CD8A和HLA−C−CD8A对的富集程度较高（图4D）。鉴于HLA分子在免疫中的核心作用，作者的发现表明这个亚群可能会影响免疫治疗的反应。此外，对CD8+疲劳T细胞与对照组之间的差异表达基因（DEGs）进行GO分析显示，在生物过程（BP）中，ATP代谢过程、有氧呼吸、细胞呼吸和氧化磷酸化显著富集；在分子功能（MF）中，富集了以氧化还原为驱动的跨膜转运活性和NADH脱氢酶活性；在细胞组分（CC）方面，富集了线粒体内膜、线粒体蛋白复合物和线粒体内膜蛋白复合物（图4E）。最后，与差异表达基因（DEGs）显著相关的KEGG通路包括与亨廷顿病、朊病、热能产生、肌萎缩性侧索硬化症以及其他神经退行性疾病相关的通路（图4F）。  图4 丰富的通路分析 4. 卵巢癌预后模型 为了确定与CD8+ T细胞耗竭相关的预后基因，作者对该亚群中的差异表达基因进行了单变量Cox回归分析。作者筛选出了47个预后基因，并将其纳入随机森林分类器中。最终确定了7个基因，包括MOB1A、TIMM8B、CD38、HINT2、NAA38、DLEU2和TXNDC17，并使用随机森林分类器构建了预后模型（图5A）。  图5 OV预后模型的构建 根据中位风险评分，TCGA队列中的患者被分为低风险组和高风险组。如图5B所示，低风险评分的患者具有明显更好的生存期。利用训练集的中位总体风险评分，作者将外部GSE140082队列中的患者分为高风险组和低风险组。正如预期的那样，低风险组与高风险组相比，生存期明显更好，从而验证了作者的预后模型（图5C）。为了准确估计个体卵巢癌患者的生存状况，作者基于总体风险评分、年龄和肿瘤分期开发了一个预测性判定图。如图5D所示，基于总体风险评分的判定图可以准确预测卵巢癌患者的生存期。 5. 基于免疫环境的高风险和低风险患者的区分 除了CD38外，预后模型中的其他基因彼此之间显示出显著的相关性（图5E）。此外，TIMM8B、CD38、HINT2、NAA38和TXNDC17在低风险患者中显著上调，而高风险组中检测到更高水平的MOB1A（图5F）。由于免疫环境在肿瘤的发展和进展中起着关键作用，作者使用MCPcounter和xCell比较了高风险组和低风险组的免疫浸润情况。根据MCPcounter算法，与高风险组相比，低风险组的患者具有显著更多的浸润性CD8+ T细胞、细胞毒性淋巴细胞、髓样树突状细胞和NK细胞，而后者的中性粒细胞丰度显著更高（图6A）。作者还发现CD38与大多数免疫相关基因之间存在显著关联（图6B）。此外，B细胞系和细胞毒性淋巴细胞与TRS呈显著负相关（图6C）。xCell算法也显示了高风险组和低风险组之间免疫细胞组成的显著差异。如图6D所示，高风险患者中aDC细胞、M1巨噬细胞、M2巨噬细胞、Th1细胞和Th2细胞的丰度显著更高。因此，高风险组的不良预后可能是由于不同的免疫环境所致。此外，作者发现CD4+记忆T细胞与TRS之间存在显著的负相关，嗜酸性粒细胞和肥大细胞与TRS之间存在显著的正相关（图6E）。  图6 免疫细胞浸润分析 6. 在卵巢细胞中抑制CD38的表达降低了它们的恶性潜力 CD38是唯一一个与卵巢癌患者预后指标显著相关的模型基因。此外，与正常卵巢组织相比，CD38的表达水平在卵巢癌组织中显著增高（图7A）。与此一致，卵巢癌细胞系A2780的CD38水平较正常卵巢细胞IOSE80更高（图7B）。为了进一步评估CD38在卵巢癌中的生物功能，作者在A2780细胞中沉默了该基因。如图7C所示，在基因沉默后，卵巢癌细胞中的CD38显著下调。此外，CD38的沉默显著增加了卵巢癌细胞的凋亡率（图7D），并抑制了它们在Transwell实验中的侵袭能力（图7E）。因此，CD38是卵巢癌的潜在治疗靶点。  图7 CD38抑制了OV细胞的恶性潜力 7. 鉴定用于卵巢癌的候选药物 此外，作者还研究了TRS与免疫调节因子表达之间的关系。结果显示，TRS与大多数免疫检查点呈负相关，这表明TRS可能用于预测免疫治疗的疗效（图8A）。为了进一步评估卵巢癌患者的化疗敏感性，作者评估了每种化合物的敏感性得分。高风险组和低风险组之间有六种药物的敏感性显著不同。高风险组患者对AZD6738、Ribociclib、AZD3759、LCL161和Navitoclax更敏感，而低风险组对BI−2536更敏感（图8B）。此外，MOB1A与大多数药物呈显著正相关，CD38与BI−2536、RO−3306和Tozasertib呈相关关系（图8C）。  图8 药物敏感性分析 总结 本文中添加了单细胞转录组信息，以进一步揭示T细胞耗竭的机制，进一步探索了与卵巢癌相关的T细胞耗竭基因，构建了一个预测预后和治疗效果的模型。同时，作者的研究存在一些局限性。TRS是使用公共数据库的数据开发和验证的，并未在真实世界的队列中进行进一步验证。未来的研究将重点关注在多中心、大队列数据中对TRS进行更强有力的验证。 |
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